[发明专利]附着点组织处免疫细胞体外模型的构建方法

说明书

本发明公开了一种附着点组织处免疫细胞体外模型的构建方法，包括：1)附着点软组织和周围骨分离；2)将附着点软组织进行酶消化处理，周围骨组织进行酶消化处理或机械分离处理；3)过滤、离心弃上清，并加入培养基重悬细胞；5)用淋巴细胞分离液分层后离心，将棕黄色的淋巴细胞层转出并用PBS溶液稀释；6)离心弃上清，用培养基重悬细胞；7)分选出所需细胞并接种于微孔上加入培养基培养，获得免疫细胞体外模型；本发明通过构建附着点组织处免疫细胞的体外模型，方便后续从细胞层面对附着点组织处进行更深层次的机理研究，也为后续研究由附着点组织处引发的相关疾病的机制和治疗提供重要的技术支持，具有很好的应用前景。

技术领域

本发明属于细胞培养领域，特别涉及附着点组织处免疫细胞体外模型的构建方法。

背景技术

附着点为人体内肌腱、韧带等附着在骨质上的组织，具有分布广、部位小、数量多等特点。人体全身的附着点数量多达2000个左右，在日常生活运动时附着点承受着较大的机械应力，附着点的损伤及后续修复不良会直接或间接的导致多种疾病的发生，进而对人体健康和日常生活造成影响，所以对附着点的研究显得尤为重要。

现有技术大都采用无创超声或核磁共振等影像手段提取附着点处的各项特征信息、观察附着点处的结构变化，以此对附着点进行研究，核磁共振常用于观察髋、踝、膝、腕等大关节处附着点组织，超声对于手指、足趾关节等表浅的小关节处附着点观察较为清楚，但是采用影像手段只能提取和观察到附着点组织层面的特征信息，而无法从细胞层面对附着点进行更深层次的机理研究，大大制约了对附着点处研究的进步与发展。

发明内容

本发明的目的在于提供附着点组织处免疫细胞体外模型的构建方法，解决现有技术采用影像手段只能提取和观察到附着点组织层面的特征信息，而无法对附着点进行更深层次机理研究的问题。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

附着点组织处免疫细胞体外模型的构建方法，包括如下步骤：

1)选取人体健康正常的附着点软组织及周围骨组织的部分，使用磷酸盐缓冲溶液或生理盐水清洗后，在无菌条件下将附着点软组织和周围骨分离，将附着点软组织切碎并称重，将周围骨组织咬碎并称重；

2)将步骤1)得到的附着点软组织和周围骨组织分别转移至试管中，将附着点软组织进行酶消化处理，周围骨组织进行酶消化处理或机械分离处理；

3)采用70毫米无菌过滤器对步骤2)所得的软组织处理液或周围骨组织处理液进行过滤，将滤液离心、弃去上清后，加入培养基重悬细胞；

4)另取一个试管，吸取步骤3)所得的细胞悬液，缓慢置于淋巴细胞分离液上层，然后进行离心，离心后将中间棕黄色的淋巴细胞层转出，并加入磷酸盐缓冲溶液稀释；

5)将经步骤4)处理后的样品进行离心，弃上清，采用培养基重悬细胞，得到细胞悬液。

6)从步骤5)所得的细胞悬液中分选出所需细胞，将分选出来的细胞接种于微孔板，再加入相应的细胞培养基培养，获得免疫细胞体外模型。

优选的，在所述步骤1)中采用咬骨钳将周围骨组织咬碎至5mm²，附着点软组织切碎至1-2mm²。

优选的，所述步骤2)中酶消化处理的具体方法为：向试管中加入消化溶液，再将试管放入水浴震荡器中，在36-37℃的条件下持续轻度震荡3.4-3.6h，完成震荡后加入样品溶液体积的2-3倍的磷酸盐缓冲溶液；所述机械分离处理的具体方法为：向试管内加入培养基，并将试管放入涡旋振荡器中涡旋震荡。

再优选的，其中培养基可为：Dulbecco改良Eagle培养基、RPMI-1640培养基、DMEM培养基或MEM培养基等常用培养基。