[发明专利]一种低氧培养脐带来源间充质干细胞的方法

说明书

本申请涉及间充质干细胞培养方法的技术领域，具体公开了一种低氧培养脐带来源间充质干细胞的方法。包括以下步骤：将原代脐带来源间充质干细胞接种在培养基上，置于培养温度37℃，氧气体积分数1‑3％，二氧化碳体积分数2‑2.5％，余量氮气的环境中进行传代扩增96‑108h后，收集间充质干细胞；培养基包括基础培养基和传代添加物；基础培养基为MEM、F12、低糖DMEM和高糖DMEM中的一种或多种组合物；传代添加物以培养基终浓度计，包括以下组分，谷胱甘肽11‑15μg/ml，α‑生育酚0.5‑2.5μg/ml，β‑生育酚0.5‑2.0μg/ml，乙酰唑胺2.5‑3.0ng/ml，胰岛素10‑20μg/ml，维生素C8‑10μg/ml。本申请方法可用于对脐带来源间充质干细胞进行扩增培养，且培养所得的干细胞活性高，增殖倍数高，有利于脐带间充质干细胞生物制品的推广应用。

技术领域

本申请涉及间充质干细胞培养方法的技术领域，更具体地说，它涉及一种低氧培养脐带来源间充质干细胞的方法。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)是中胚层来源的、具有高度自我更新能力和多向分化潜能的多能干细胞。目前，主要从脐带、骨髓、脂肪组织、牙髓和胎盘中提取间充质干细胞，间充质干细胞连续传代培养和冷冻保存后，仍具有多向分化潜能，为临床治疗多种疾病，如神经系统疾病、肾病、自身免疫性疾病和恶性肿瘤等的治疗提供了新的途径。

脐带来源间充质干细胞是指存在新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，具有取材方便，来源丰富，生物学特性稳定，免疫原性低的特点，使其成为未来干细胞在医疗应用的理想种子细胞。此外，脐带来源间充质干细胞能在培养过程中可分泌多种干细胞因子，包括成纤维细胞生长因子(FGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、表皮生长因子(EGF)等在内的各种生长因子，这些生长因子可促进细胞生长，维持细胞干性，并且在美容护肤领域有广泛的应用。

目前对脐带来源间充质干细胞的培养主要分为两种，其一是血清培养法，大多使用DMEM/F12+血清，或者在此基础上添加一些营养物质助于细胞生长，这一方法适用于脐带来源间充质干细胞的大规模培养，但是这一方法中使用的血清可能包含一些未知的过敏原和病原体，对细胞培养的安全性造成影响；其二是无血清培养法，单纯使用培养基及各种营养物质添加剂对期待来源间充质干细胞进行培养，然而这一方法培养的细胞生长缓慢，且细胞活性差，培养基中细胞生长因子含量较低，影响了脐带来源间充质干细胞生物制品的推广应用。

发明内容

为了改善上述提到的问题，本申请提供一种低氧培养脐带来源间充质干细胞的方法。

本申请提供的一种低氧培养脐带来源间充质干细胞的方法，采用如下的技术方案：

一种低氧培养脐带来源间充质干细胞的方法，所述方法包括以下步骤：将原代脐带来源间充质干细胞接种在培养基上，接种密度为10000-50000个/ml，置于培养温度37℃，氧气体积分数1-3％，二氧化碳体积分数2-2.5％，余量氮气的环境中进行传代扩增96-108h后，收集间充质干细胞；所述培养基包括基础培养基和传代添加物；所述基础培养基为MEM、F12、低糖DMEM和高糖DMEM中的一种或多种组合物；所述传代添加物以培养基终浓度计，包括以下组分，谷胱甘肽11-15μg/ml，α-生育酚0.5-2.5μg/ml，β-生育酚0.5-2.0μg/ml，乙酰唑胺2.5-3.0ng/ml，胰岛素10-20μg/ml，维生素C8-10μg/ml。

优选的，原代脐带来源间充质干细胞培养时，初始氧气体积分数为1％，氧气体积分数以0.1％/2h的速率增长至3％后，保持培养10h，氧气体积分数以0.1％/5h的速率下降至2.3-2.4％，保持培养至传代培养结束。

优选的，间充质干细胞培养过程中，每2天更换一次培养基。