[发明专利]pSFV-p54复制子颗粒及其制备方法与应用

说明书

本发明属于基因工程技术领域，公开了一种pSFV‑p54复制子颗粒及其制备方法与应用。所述pSFV‑p54复制子颗粒的制备方法，包括以下步骤：(1)以pSFV‑sp6‑EGFP质粒和flag‑p54基因为材料，构建得到pSFV‑sp6‑p54质粒；所述flag‑p54基因如SEQ ID NO：1所示；(2)分别将SFV‑helper辅助质粒和所述pSFV‑sp6‑p54质粒线性化并进行体外转录，将所得mRNA共电转入BHK细胞或Vero细胞中，得到pSFV‑p54复制子颗粒。本发明通过以塞姆利基森林病毒为载体，插入非洲猪瘟p54基因，所制得的pSFV‑p54复制子颗粒能够高效表达非洲猪瘟病毒p54蛋白，且具有较高的生物安全性，可应用于研制非洲猪瘟相关疫苗。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种pSFV-p54复制子颗粒及其制备方法与应用。

背景技术

非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)在病毒分类中属于DNA病毒目(dsDNA)、非洲猪瘟病毒科、非洲猪瘟病毒属(Asfivirus)，是非洲猪瘟病毒科中唯一的成员，家猪和各种野猪感染非洲猪瘟病毒会引起一种急性、出血性、烈性传染病-非洲猪瘟。非洲猪瘟临床症状以高热、食欲废绝、皮肤和内脏器官出血、高死亡率为主要特征，目前尚无有效的疫苗用于预防，一经发现只能大规模扑杀，对养猪业造成巨大损失。非洲猪瘟病毒的病毒粒子呈二十面体对称，平均直径约为200nm。病毒粒子结构由内到外分别为核质体、核衣壳、囊膜(分为外层与内层)：核质体主要由病毒基因组、DNA结合蛋白(p10、p14、p37、p34等)及基因早期转录所需的酶组成；核衣壳主要含有结构蛋白p72和p17，由大约2000个壳粒组成；内侧囊膜来源于宿主的内质网，结合着p12、p22、p54、p54及CD2v蛋白，外层囊膜为病毒出芽附带产物，松散环绕在四周。ASFV基因组为线性双链DNA分子，不同毒株全长大小不一，大致范围在170-193kb，编码150-175个蛋白。基因组由中央保守区(约125kb)、两侧可变区(分别为38-48kb、13-22kb)及基因组末端的反向重复序列(约2.1-2.5kb)组成。其中p54是由ASFV开放阅读框E183L基因编码的蛋白，是一种I型跨膜蛋白，横跨病毒粒子的内层囊膜，通过腔内的半胱氨酸形成同源二聚体。p54蛋白帮助病毒快速结合到易感细胞，刺激机体产生特异性抗体，具有一定的抗原性。在ASFV感染的细胞中，p54蛋白与内质网结合，促进内质网膜转变为病毒粒子包膜前体。p54蛋白与细胞质动力蛋白DLC8可发生特殊的交叉反应介导病毒的细胞内运输。在细胞对病毒内摄过程和病毒在细胞内的加工过程中都起着重要作用。除此之外，p54蛋白从微管中替代Bim(bcl-2interacting mediator of celldeath)，使其重新定位至线粒体，激活细胞内凋亡途径，从而引起凋亡。

近20年来，ASFV亚单位疫苗和重组疫苗得到了广泛的研究，多种参与ASFV感染机体的病毒蛋白，如p72、p54、p54等成为研究的靶蛋白，但是目前研制的亚单位疫苗和重组疫苗仍不能对机体产生足够的保护力，只能在一定程度上降低病毒血症水平，延缓临床症状出现的时间。因此，本发明希望提出一种能高效表达病毒蛋白，且安全性高的方法，以期获得性能更佳的疫苗类产品。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种pSFV-p54复制子颗粒及其制备方法与应用。通过以塞姆利基森林病毒(Semliki forestvirus，SFV)为载体，插入非洲猪瘟p54基因，所制得的pSFV-p54复制子颗粒能够高效表达非洲猪瘟病毒p54蛋白，且具有较高的生物安全性，可应用于研制非洲猪瘟相关疫苗。

本发明提供一种pSFV-p54复制子颗粒的制备方法，包括以下步骤：

(1)以pSFV-sp6-EGFP质粒和flag-p54基因为材料，构建得到pSFV-sp6-p54质粒；所述flag-p54基因如SEQ ID NO：1所示；