[发明专利]基于AI-2分子响应的启动元件及其构建的大肠杆菌动态调控系统和方法

说明书

本发明公开了一种基于AI‑2分子响应的启动元件及其构建的大肠杆菌动态调控系统和方法，构建了一种基于AI‑2分子响应的细胞密度依赖型启动元件Psubgt;J23119/subgt;‑LsrR‑Psubgt;lsrA/subgt;，利用该元件可以自诱导dCpf1的表达，进一步通过组装不同靶基因的crRNA，可以将该自诱导元件用于dCpf1‑CRP对合成途径上的基因进行动态调控。本发明通过构建载体pACYDuet‑Psubgt;J23119/subgt;‑LsrR‑Psubgt;lsrA/subgt;‑dCpf1‑CRP、pRSFDuet‑GFP‑mCherry和pETDuet‑crRNA，可以用于同时对不同基因进行转录激活和抑制。本发明重组大肠杆菌的构建方法简单，具有很好的应用前景。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，特别涉及一种基于AI-2分子响应的启动元件及其构建的大肠杆菌动态调控系统和方法。

背景技术

大肠杆菌(Escherichia coli)长期以来被广泛用作分子生物学的实验室菌株，促进了DNA复制、转录、翻译和表达中许多重要机制的发现。此外，大肠杆菌因其生长发育快速，培养条件简单，代谢可塑性强，生化和生理功能丰富，是实验室和工业应用的首选原核生物。大肠杆菌较为完善的生物化学、生理学和遗传学性质使大肠杆菌在代谢工程和合成生物学方面的研究取得了迅速进展，已被广泛用作工业宿主代谢合成如赖氨酸、1,3-丙二醇和1,4-丁二醇。大肠杆菌菌株通常被认为是无害的，如实验室菌株E.coli MG1655，被认为是缺乏与人类疾病相关的毒力因子，已被广泛应用于生产各种生物化学品、食品和生物燃料。

可编程的位点特异性基因调控元件在全基因组层次的基因功能研究、代谢通路调控以及人工基因线路设计中发挥重要作用。基于间隔短回文重复序列(Clusteredregularly interspaced shortpalindromic repeat sequences,CRISPR)的基因调控工具是目前最受欢迎的一种基因调控技术，利用CRISPR技术可以对微生物进行多基因的调控。CRISPR基因调控系统是通过引导RNA(如sgRNA、crRNA等)引导缺陷型核酸酶(如dCas9、dCpf1等)定位到靶基因位点时，并不切割DNA，而是与转录阻遏域融合，形成的RNA-蛋白质复合物被引导到靶基因的转录起始位点以抑制其转录；而当dCas蛋白C端融合转录激活因子时，dCas蛋白与转录激活因子可在转录起始位点激活靶基因的转录。近年来，随着CRISPR-dCpf1系统的可编程转录因子的出现，基因表达的合成控制变得更加简单。相比CRISPR-dCas9系统，CRISPR-dCpf1优势明显，具有更低的脱靶效率。此外，dCpf1只需要单个RNA引导，而dCas9的引导需要sgRNA和tracrRNA两个RNA的共同作用。因此，CRISPR-dCpf1系统更适合多个基因位点的调控。