[发明专利]一种黑色素瘤软脑膜转移模型构建方法

权利要求书

1. 一种黑色素瘤软脑膜转移模型构建方法，具体步骤如下：

（1）细胞培养

将使用的黑色素瘤细胞株在细胞培养皿中用RPMI-1640完全培养基培养；将使用的包装慢病毒的293T细胞株在细胞培养皿中用DMEM完全培养基培养；黑色素瘤细胞和293T细胞分别放在无菌培养箱中培养，培养箱保持37℃的温度，CO₂浓度维持在4-6%，并且培养箱中始终含有无菌的灭菌水以保证培养箱内的湿度，使细胞更好地生长；

（2）病毒包装

构建可同时稳定表达荧光素酶以及荧光蛋白的慢病毒转移质粒载体；慢病毒转移载体以及包装载体经过高纯度无内毒素质粒提取试剂盒提取后，使用转染试剂共转染293T细胞，共转染时293T细胞融合度为30%-50%，转染后6-10小时及时更换为完全培养基，36-72小时后，收集并过滤病毒上清液；

（3）病毒感染

将黑色素瘤细胞平铺于细胞培养皿中，使细胞密度为30%-70%；将病毒上清加入细胞培养皿中，病毒上清的体积和完全培养基的体积比在0.5-2之间；加入2-5 µg/mL polybrene,充分摇匀后置于无菌培养箱中培养；病毒感染后12-24小时换液，待细胞长满后传代并用荧光素酶的底物检测荧光素酶的表达；

（4）流式分选

将慢病毒感染后的黑色素瘤细胞以200g的速度离心5分钟，弃上清；使用含有抗生素的完全培养基重悬细胞，放在冰上待用；流式分选之前，用40 µm的细胞筛将重悬的细胞过滤到流式管中，继而对慢病毒感染后的细胞进行分选；分选后的细胞经过扩增培养，获得表达荧光蛋白的黑色素瘤细胞系，称为parental细胞，简称Par细胞；该细胞系可以同时稳定表达荧光素酶以及荧光蛋白，其中荧光素酶的表达可用于生物发光成像，以便实时监测肿瘤位置和肿瘤负荷；荧光蛋白的表达可用于对肿瘤细胞进行分选以及抗体染色；

（5）软脑膜转移模型构建

将1×10⁴-3×10⁴个Par细胞注射到小脑延髓池中，待Par细胞适应软脑膜环境，具备增殖能力，产生明显神经症状后，对小鼠实施安乐死；收集脑脊液中的肿瘤细胞，建立体外培养细胞系，该细胞称为驯化细胞1，简称dome1细胞)；将1×10⁴-3×10⁴个dome1细胞注射到小脑延髓池中，待demo1细胞适应软脑膜环境，具备增殖能力，产生明显神经症状后，对小鼠实施安乐死；收集脑脊液中的肿瘤细胞，建立体外培养细胞系，该细胞系称为驯化细胞2，简称dome2细胞；dome2细胞可较好地适应脑脊液中的生存环境；将2×10⁴-5×10⁴个dome2细胞注射到小鼠左心室，细胞通过血液播散进入到软脑膜微环境中，待小鼠出现软脑膜转移现象，对小鼠实施安乐死；收集脑脊液中播散的原代肿瘤细胞，建立体外培养细胞系，将该细胞系称为软脑膜转移细胞，简称LM细胞；LM细胞是可以通过血液播散，稳定形成软脑膜转移灶的细胞，将LM细胞注射到小鼠的左心室后可获得黑色素瘤软脑膜转移小鼠模型。