[发明专利]一种黑色素瘤软脑膜转移模型构建方法

说明书

本发明属于生物技术领域，具体为一种黑色素瘤软脑膜转移模型构建方法。本发明方法包括：黑色素瘤细胞株和293T细胞株的培养；慢病毒包装；慢病毒感染；荧光素酶和荧光蛋白共表达黑色素瘤细胞系的获得；黑色素瘤软脑膜转移小鼠模型的构建。软脑膜转移（LM）是黑色素瘤患者死亡的重要原因。当前尚无合适的黑色素瘤软脑膜转移小鼠模型。本发明有助于深入探究黑色素瘤软脑膜转移的发病机制，为癌症软脑膜转移治疗提供新的技术手段和软脑膜转移动物模型。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及黑色素瘤软脑膜转移小鼠模型的构建方法。

背景技术

癌症是威胁人类生命的重大疾病,《临床肿瘤杂志》2021年公布的数据显示，2020年全球新发癌症病例1930万例[1]。黑色素瘤通常指恶性黑色素瘤，是来源于黑色素细胞的一种高度恶性的肿瘤，多发生于皮肤，也可见于黏膜和内脏[2, 3]，其发病率和死亡率在世界范围内均不断增加[4-6]。手术切除是所有阶段黑色素瘤的主要治疗方法，晚期或转移性黑色素瘤的治疗通常会结合免疫疗法、放疗或化疗等辅助治疗[2, 7]。黑色素瘤患者的死亡与肿瘤转移密切相关[8]，黑色素瘤最常见的远端转移部位是脑部，在全体脑转移患者中，约6-11%的脑转移来源于黑色素瘤。一旦发生脑转移，患者预后极差[9]。

脑转移瘤分为脑实质转移（parenchymal metastasis，PM）和软脑膜转移（leptomeningeal metastasis, LM）[10]。肿瘤软脑膜转移是癌症患者死亡的重要原因[11]，是全身恶性癌症的最严重的并发症。其主要特征是肿瘤细胞转移到颅内，并播散在脑脊液中，随脑脊液弥漫性或多发性定植生长，从而导致脑脊液循环出现障碍，进而影响神经系统功能。黑色素瘤是常见的发生软脑膜转移的实体瘤之一，其软脑膜转移的发生率在6-18%，且呈逐年上升的趋势[12]。黑色素瘤软脑膜转移患者的预后极差，疾病进展迅速，患者中位生存期仅为8-10周，目前临床上尚缺乏有效的治疗手段和干预药物[13-15]。

人们对黑色素瘤软脑膜转移发展的分子和遗传机制知之甚少，对转移早期的入侵途径尚不明确。因此深入剖析黑色素瘤进入软脑膜的主要途径与微环境决定因素是治疗黑色素瘤软脑膜转移的关键突破口。早期，Dr. Boire等人利用肿瘤细胞在脑膜空间的多轮适应性驯化以及血液循环的筛选方法成功建立了肺癌和乳腺癌软脑膜转移动物模型[16]。但是目前仍然缺乏黑色素瘤软脑膜转移的动物模型，因此当前研究中迫切需要建立有效的黑色素瘤软脑膜转移模型。

发明内容

本发明的目的在于提供一种简单、高效且能够广泛应用的黑色素瘤软脑膜转移模型构建方法，并将模型用于黑色素瘤软脑膜转移机制的研究。

本发明提供的黑色素瘤软脑膜转移模型构建方法，具体步骤如下：

（1）细胞培养

将本发明使用的黑色素瘤细胞株在细胞培养皿中用RPMI-1640完全培养基培养；使用的包装慢病毒的293T细胞在细胞培养皿中用DMEM完全培养基培养。黑色素瘤细胞和293T细胞放在无菌培养箱中培养，培养箱保持37℃的温度，CO₂浓度维持在5%左右（如4-6%），并且培养箱中需要始终含有无菌的灭菌水以保证培养箱内的湿度，使细胞更好地生长。

（2）病毒包装

构建可同时稳定表达荧光素酶以及荧光蛋白的慢病毒转移质粒载体。慢病毒转移载体以及包装载体经过高纯度无内毒素质粒提取试剂盒提取后，使用转染试剂共转染293T细胞，共转染时293T细胞融合度为30%-50%，转染后6-10小时及时更换为完全培养基，36-72小时后，收集并过滤病毒上清液。

（3）病毒感染