[发明专利]TET酶活性测定方法及TET酶活性小分子激活剂或抑制剂的高通量筛选方法

说明书

本发明提供了一种TET酶活性测定方法，其特征在于其步骤包括：将5mC DNA与待测TET酶混合后孵育；在反应体系中加入SDH和DCPIP进行反应；加入三氯乙酸终止反应；酶标仪测量反应液在600nm处的吸收峰值，峰值越高则代表酶活性越强。还公开了SDH和DCPIP联合在测定TET酶活性中的应用，以及TET酶活性小分子激活剂或抑制剂的高通量筛选方法。本发明提供了一种简便快速的TET酶活性测定方法，利用TET酶氧化反应产物琥珀酸盐在琥珀酸脱氢酶的催化下释放出还原氢，还原氢被DCPIP捕获生成DCPIPH2（蓝色），在波长600 nm处出现特异性的吸收峰。整个方法流程只需要4步操作、一管式反应、耗时1 h即可完成，具有成本低、通量大、适用范围广和准确性高的优点。

技术领域

本发明专利涉及一种TET酶活性测定方法及TET酶活性小分子激活剂或抑制剂的高通量筛选方法，属于生物技术领域。

背景技术

胞嘧啶甲基化（5mC）是DNA上最常见的修饰碱基，占所有胞嘧啶的1%-8%，是DNA甲基化的主要形式。有些特定的胞嘧啶位点如细菌的Dam甲基化位点或真核生物的CpG岛中的胞嘧啶位点发生甲基化修饰的比例可高达近100%，因此5mC也被称为“第五种碱基”。DNA甲基化是调控基因表达的重要形式，主要介导基因的沉默。这种由DNA甲基化介导基因沉默的调控方式在生命体内时刻发生，是基因差异性表达的分子基础，也是决定胚胎发育、细胞功能性分化、个体生长、衰老和病变的关键途径。比如，细胞分化过程中维持细胞干性的基因会高度甲基化来抑制自身的表达，而促进细胞分化的组织特异性功能基因会去甲基化来增强自身的表达活性。这种有条不紊的甲基化/去甲基化稳态是保证细胞正常生理状态的基础。DNA 5mC双加氧酶家族TET（又称为DNA 5mC羟化酶）是DNA去甲基化的主要蛋白，能够介导5mC-5hmC-5fC-5caC的氧化。人的TET酶家族有3个成员，TET1、TET2和TET3，这三个蛋白在不同的生命周期行使着DNA去甲基化的功能。在许多疾病的病程中，都出现由于TET酶活性失调（表达量变化、基因重排、基因突变、蛋白定位改变等因素）而造成的疾病相关基因表达紊乱的现象，如肿瘤、白血病、自身免疫病、遗传性疾病等。因此，TET酶活性成为许多疾病诊断和治疗的重要靶标，针对TET酶的小分子增强剂和抑制剂药物也成为临床上治疗相关疾病的关键突破口。但是，TET酶活性的测定是DNA甲基化临床诊治和科学研究的一大难题。

由于TET酶介导的5mC氧化存在复杂的三重催化反应（5mC-5hmC-5fC-5caC），现有的酶活测定方法很难准确有效的测定TET酶的活性。现有的TET酶活性测定方法主要分为三种。第一种是基于液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）的检测方法，将TET酶氧化的m5C oligo回收后经核酸酶消解，并通过LC-MS分析底物m5C和氧化产物5hmC、5fC和5caC的占比，从而判断TET酶的活性。这种方法的优势是可以区分TET酶各个阶段的氧化产物，但是背景重、操作复杂、成本高、准确性差、难以用于高通量分析。第二种方法是点杂交检测技术， 5mC DNAoligo经TET氧化后的交联到尼龙膜上，分别利用5mC、5hmC、5fC和5caC抗体进行杂交，最后利用特殊标记二抗进行信号放大和显色。这种方法因为同时可以检测多个样本而被广泛使用，但是这种方法通量较小、操作复杂、成本高，且难以进行定量分析。第三种方法使用酶联免疫吸附测定法（ELISA）进行活性测定。将TET酶氧化的5mC DNA oligo固定到96孔板中，加入5hmC抗体结合，并通过标记二抗进行显色反应。这种方法虽然可以定量分析，通量比前两种大，但操作复杂，成本高，且只能分析5hmC一种反应中间产物的含量，无法准确地对TET酶的活性进行测定（高活性的TET酶可能因为氧化产物中5caC占比升高和5hmC占比降低而被此方法测定为低活性）。这三种方法都因为耗时长（8 h以上）和操作复杂（数百步操作），成为TET酶活自动化检测以及高通量小分子激活剂和抑制剂药物筛选的巨大障碍。

发明内容