[发明专利]一种神经递质γ-氨基丁酸荧光探针iGABASnFR的浮萍表达载体及其构建方法

说明书

本发明公开了一种神经递质γ‑氨基丁酸荧光探针iGABASnFR的浮萍表达载体及其构建方法。本方法通过全基因合成iGABASnFR序列作为模板，设计iGABASnFR基因特异性引物，经过PCR、酶切，将产物与烟草花叶病毒35S启动子和NOS终止子之间相连接，最终经过双酶切，构建到植物双元表达载体1301上。通过PCR鉴定、双酶切鉴定和基因测序，最终确定完成浮萍表达神经递质γ‑氨基丁酸荧光探针iGABASnFR载体的构建。本项发明中构建方法具有简单、便捷、易操作、保存1301载体原有GUS基因易于进行筛选等特点，可应用于浮萍表达神经递质γ‑氨基丁酸荧光探针iGABASnFR应用研究，是浮萍抗逆境胁迫机理研究不可或缺的关键操作。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体来说涉及一种神经递质γ-氨基丁酸荧光探针iGABASnFR的浮萍表达载体及其构建方法。

背景技术

浮萍是单子叶水面漂浮植物，隶属于浮萍科浮萍属，广布于世界各地，其个体小，扩繁快，对环境的适应能力强，对盐碱水环境有一定的抗性，对重金属镉离子有富集能力。但是，对于浮萍富集重金属的生理机制和分子机制尚未阐明。常规野生浮萍无法直接应用于机制研究中，重金属污染水境的生态学修复和植物抗重金属应用的研究难以开展，一种可用于机制研究的浮萍有待于进一步研究和开发。γ-氨基丁酸(简称GABA)是哺乳动物中枢神经系统中重要的抑制性神经递质，约30％的中枢神经突触部位以GABA为递质，它主要存在于神经元的细胞膜上。美国霍华德休斯医学研究所Loren L.Looger教授研究团队在Nature Methods上发表A genetically encoded fluorescent sensor for in vivoimaging of GABA的文章基于谷氨酸受体iGluSnFR的原理，开发出可检测GABA浓度的荧光探针iGABASnFR。该文章通过基于兴奋性神经递质荧光探针的原理设计出抑制性神经递质荧光探针iGABASnFR，可以实现快速、稳定的检测到胞外GABA的浓度。这一技术有望应用于浮萍的机制研究。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种神经递质γ-氨基丁酸荧光探针iGABASnFR的浮萍表达载体及其构建方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种神经递质γ-氨基丁酸荧光探针iGABASnFR的浮萍表达载体，其构建方法如下所述：

步骤一、根据iGABASnFR基因序列进行全基因合成。

步骤二、T-iGABASnFR的构建：利用iGABASnFR特异性引物，以全基因合成序列为模板，通过PCR技术获得带有特定酶切位点的荧光探针基因，并将其连接到T-载体上，所述T-载体采用pMD19-T质粒，所述iGABASnFR特异性引物如下所述：

iGABASnFR上游引物：CGCGGATCCGCG ATGGAGACAGACACACTC，其中在5’末端加上了BamH I酶的酶切位点及保护碱基：CGCGGATCCGCG；

iGABASnFR下游引物：GCTCTAGAGC CTAACGTGGCTTCTTCTG，其中在5’末端加上了XbaI酶的酶切位点及保护碱基：GCTCTAGAGC。

步骤三、最终载体的构建：对iGABASnFR和pCAMBIA-1301-35SN载体同时进行双酶切，所采用的限制性内切酶为BamH I和Xba I，对产物利用T4连接酶进行连接，经过PCR鉴定、双酶切鉴定和基因测序并比对结果为100％正确后，最终获得植物表达神经递质γ-氨基丁酸荧光探针iGABASnFR的载体。

本发明的优点和有益效果为：

1.本发明首创了浮萍表达神经递质γ-氨基丁酸荧光探针载体的构建方法，利用该技术可获得一种能荧光显示γ-氨基丁酸含量的浮萍，应用于浮萍细胞水平研究，填补了浮萍γ-氨基丁酸实时观测的空白。