[发明专利]噬菌斑的培养和观察方法

权利要求书

1.一种噬菌斑的培养和观察方法，具体包括以下步骤：

步骤1：水样预检，其特征是选择总大肠菌群阳性的环境水样为噬菌体分离培养材料；

步骤2：制备菌悬液，其特征是无菌操作从伊红美兰培养基上挑取一个深紫红色、有金属光泽的单菌落，接种5ml牛肉膏蛋白胨液体培养基，37℃，150rpm培养1～3hour；

步骤3：水样处理与增殖噬菌体，其特征是取污水2ml，4℃，10000rpm离心1min，收集上清，上清中加0.2ml氯仿涡旋振荡1min，静置，收集上层液体1ml添加于5ml牛肉膏蛋白胨液体培养基中，同时添加0.2ml大肠杆菌的菌悬液，37℃，150rpm过夜培养以增殖噬菌体；

步骤4：噬菌体增殖液的稀释，其特征是取2ml噬菌体增殖液4℃，10000rpm离心1min收集上清液，上清加0.2ml氯仿涡旋震荡1min，静置，上层液体为富集的噬菌体样品；用1％的蛋白胨水将富集的噬菌体样品10倍倍比稀释到10^-3～10^-7；

步骤5：噬菌体-宿主混合液的制备，其特征是在制备好的噬菌体梯度稀释液中添加大肠杆菌菌悬液，添加比例为每1ml稀释液添加50μl菌悬液，颠倒混匀；

步骤6：夹层平板法培养噬菌斑，其特征是在无菌平皿中加入约5ml水琼脂，冷却待凝固；再将混匀的宿主-噬菌体混合液1050μl倾倒在已经凝固的底层平板上，随即倾入一层保温的半固体培养基，混匀，每皿约10ml，静置待凝；最后，在上层再倒入一层保温的水琼脂，每皿约10ml，待凝固后37℃倒置培养过夜；

步骤7：染色观察噬菌斑，其特征是先将培养好的夹层平板水洗，去除表面污染的杂菌和灰尘，吸干残水后用0.05％亚甲基兰水溶液染色2min，之后倾去染液，观察，背景为蓝色，大肠杆菌菌苔呈不透明云雾状，噬菌斑为深蓝色圆形空斑。

2.如权利要求1所述方法，步骤1的特征为选择总大肠菌群阳性的水体为检测对象，即水体中存在37℃发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。

3.如权利要求1所述方法，步骤6的夹层平板，从下到上共包括三层，首先在底层铺一层不含任何营养成分的水琼脂，补平玻璃平皿；其次，在已凝固的底层平板上倾倒宿主菌和噬菌体的混合液，随即倒入保温的半固体牛肉膏蛋白胨培养基，混匀；最后，待中间层凝固后，再在上面铺一层不含任何营养成分的水琼脂。

4.如权利要求3所述方法，中间层半固体培养基的琼脂量选择1％，这样便于凝固后倾倒水琼脂。