[发明专利]噬菌斑的培养和观察方法

说明书

本发明为一种噬菌斑的培养和观察方法，以大肠杆菌为宿主，分离噬菌体，培养噬菌斑，包括水样的预检、制备菌悬液、水样处理与噬菌体增殖、噬菌体增殖液的稀释、噬菌体‑宿主混合液的制备、夹层平板法培养噬菌斑和染色观察等步骤，最终观察到清晰的噬菌斑。大肠杆菌菌苔呈淡蓝色云雾状，噬菌斑则呈一个个深蓝透明的小圆形空斑。相比传统的双层平板法，本方法显著降低了实验的操作难度，降低了污染其它环境微生物的风险，提高了实验的成功率，是一种良好的教学实验方法，可应用于高校教学或相关技术人员培训中。本发明中的夹层平板法亦可用于其它噬菌体形成的噬菌斑的培养和观察，但需调整相关步骤。

技术领域

本发明属于微生物技术领域，涉及一种噬菌斑的培养和观察方法。

背景技术

噬菌体(phage)是感染细菌、放线菌及蓝细菌等原核生物的病毒，是遗传学、分子生物学和基因工程的常见实验材料，广泛存在于自然界的各个生境中。根据其侵染宿主后是否裂解宿主，可分为烈性噬菌体和温和噬菌体。烈性噬菌体会侵染宿主在菌苔上形成一个个具有一定形状、大小、边缘和透明度的噬菌斑。因每种噬菌体的噬菌斑有一定的形态，故可用作噬菌体的鉴定指标，也可用于纯种分离和计数。

噬菌体的分离纯化是普通微生物学实验、病原微生物学实验和环境工程微生物学实验等课程的必做项目之一。噬菌斑的培养和观察，是本实验项目的核心技术。目前，国内外教材多沿用Adams1959年发明的双层平板法，其主要步骤为:预先分别配制含2％和0.7％琼脂的底层培养基和上层培养基。先用底层培养基在培养皿上浇一层平板,待凝固。再把预先融化并冷却到45℃的上层培养基混合较浓的敏感宿主和一定体积的噬菌体待检液，混匀后铺平在已凝固的底层平板上，如存在能裂解宿主菌的噬菌体，则培养一段时间后，出现肉眼可见的噬菌斑。该方法存在几个显著的缺点：

(1)使用预先融化的上层培养基混合宿主和噬菌体，温度很难把握。低于45℃，上层琼脂在混合过程中即凝固，高于60℃，则噬菌体有灭活的风险，所以初学者往往手忙脚乱，且上层琼脂很容易因凝固而出现琼脂块。

(2)肉眼观察难度大。虽然用底层培养基补平，避免了玻璃培养皿底部凹凸不平，但由于大肠杆菌菌落无色半透明，琼脂虽透明亦呈现淡黄色，仅凭肉眼观察，初学者很难辨识噬菌斑。

(3)培养基营养丰富，对实验环境和操作技术要求较高，很容易被环境中的其它微生物污染，干扰实验结果。

(4)观察时间苛刻。尽管多数教程规定培养后18-24h观察。但实际上噬菌斑的最佳观察时间在培养的4-20h之间，超过20h往往会出现斑块界限模糊，可能是因为上层培养基很软，方便宿主或污染的其它杂菌在琼脂表面运动。

此外，在噬菌斑培养前期的噬菌体增殖环节，教材多选用大容量污水(200ml)直接增殖噬菌体。该步骤有两个缺陷，一是实验材料体积较大，操作不便；二是污水中同时包含多种微生物，这些微生物均可在营养丰富的牛肉膏蛋白胨液体培养基中增殖，因此，本步骤并没有选择性的增殖大肠杆菌噬菌体。

为了增加噬菌斑和背景的对比度，研究人员在上层琼脂中添加红四氮唑等染料，但染料对大肠杆菌的生长存在一定的抑制。或在培养后用2,3,5氯化三苯基四氮唑(TTC)染色，染色后倾去染料，染料被菌苔中的活细胞还原，从而使噬菌斑和菌苔呈现鲜明对比。然而上层琼脂软(0.7％)，硬度低，且大肠杆菌菌落与培养基结合不紧密，染色过程中很容易将菌苔冲起或将上层培养基破坏，进而也无法观察和计数噬菌斑。

发明内容

本发明为一种改良的噬菌斑培养和观察方法，在双层平板法的基础上，将底层琼脂改成无营养物的水琼脂，同时将双层平板改成三层，即两层水琼脂中间夹一层半固体琼脂，将宿主菌和噬菌体局限在中间层，这样既降低了环境中微生物在平板上定殖的风险，也使形成的噬菌斑都接近于同一平面上，避免了噬菌斑的上下重叠。培养完毕，洗去表层水琼脂上污染的其它杂菌，用低浓度亚甲基蓝染色后可清晰的观察到噬菌斑，噬菌斑的大小接近、边缘清晰，无上下噬菌斑的重叠现象。发明包括以下步骤：