[发明专利]融合基因RIL-7联合CCL19重组溶瘤牛痘病毒及其在制备抗肿瘤药物中的应用

权利要求书

1.融合基因RIL-7联合CCL19重组溶瘤牛痘病毒，其特征在于，所述融合基因RIL-7联合CCL19重组溶瘤牛痘病毒，代号VV-RIL-7-CCL19，是在基因组序列以GenBank:AY243312.1为基准的牛痘病毒母本基因组的第81001bp位置之后插入融合基因RIL-7、趋化因子CCL19及调控元件的基因序列；其中，所述插入牛痘病毒母本基因组中的基因序列见S1或S1’。

2.如权利要求1所述的融合基因RIL-7联合CCL19重组溶瘤牛痘病毒，其特征在于，所述融合基因RIL-7由以下三个基因片段连接而成：片段1为剔除终止密码的IL-7基因序列；片段2为连接肽基因，为EA3K刚性连接肽序列，或(G4S)3柔性连接肽序列；片段3为细胞膜锚定基因序列，是剔除起始密码的CD16b的GPI锚定序列；依据片段2连接肽基因的差异，所述融合基因RIL-7的碱基序列见S2或S2’。

3.如权利要求1所述的融合基因RIL-7联合CCL19重组溶瘤牛痘病毒，其特征在于，所述VV-RIL-7-CCL19由以下方法建立：

1)细胞膜锚定型融合基因RIL-7的构建：通过PCR将删除终止密码的野生型IL-7的基因序列、EA3K刚性连接肽序列或(G4S)3柔性连接肽序列，和CD16b的GPI锚定序列拼接为融合基因，命名为RIL-7；

2)融合基因RIL-7两翼导入限制性酶切位点：通过PCR在融合基因RIL-7的两翼导入SdaI和HpaI限制性酶切位点，分离基因片段；

3)牛痘病毒VV同源重组载体PV-1粘性末端的制备：使用SdaI和HpaI切割VV同源重组载体PV-1，分离质粒片段；

4)融合基因RIL-7与VV同源重组载体PV-1粘性末端的连接：连接步骤2)和步骤3)中的回收产物；

5)转化感受态细胞并筛选阳性克隆：步骤4)的连接产物与感受态大肠杆菌共孵育，扩大培养后，抽提重组质粒，并经基因测序确认融合基因RIL-7正确克隆入同源重组载体，命名为PV-RIL-7；

6)通过PCR将SalI和SgsI引入CCL19基因两翼，回收PCR产物后使用SalI和SgsI双酶切，分离基因片段备用；

7)载体PV-RIL-7粘性末端的制备：使用SalI和SgsI切割VV同源重组载体PV-RIL-7的另一个多克隆插入位点，分离质粒片段备用；

10)CCL19基因与PV-RIL-7同源重组载体粘性末端的连接：采用试剂盒连接步骤1)和步骤2)中的回收产物；

11)转化感受态细胞并筛选阳性克隆，步骤10)的连接产物与感受态大肠杆菌共孵育，培养后抽提质粒，基因测序确认CCL19基因正确克隆入同源重组载体，命名为PV-RIL-7-CCL19；

12)融合基因RIL-7与CCL19基因同时重组入VV基因组并删除TK基因：VV在肿瘤细胞内复制的同时，PV-RIL-7-CCL19与之进行同源重组；融合基因RIL-7、CCL19基因以及示踪用黄荧光蛋白(YFP)基因序列同时被同源重组入VV基因组的TK基因内部，形成重组病毒；与此同时，由于外源基因的插入，TK基因被破坏(即TK基因被删除)；进而筛选单克隆重组VV，获得高纯度重组VV；

13)将所获得高纯度重组VV感染表达cre酶的293T细胞，切除重组VV基因组中的YFP基因，而后筛选单克隆重组VV，获得含有重组病毒的种子，并通过基因测序分析确认融合基因RIL-7以及CCL19基因重组入VV，最终获得融合基因RIL-7联合CCL19基因重组溶瘤牛痘病毒，命名为VV-RIL-7-CCL19。

4.融合基因RIL-7联合CCL19重组溶瘤牛痘病毒在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述重组溶瘤牛痘病毒VV-RIL-7-CCL19，即趋化因子CCL19基因序列和融合基因RIL-7序列插入牛痘病毒母本基因组第81001bp位置之后并敲除TK基因得到的重组溶瘤牛痘病毒，所述融合基因RIL-7即删除终止密码的白细胞介素-7基因、连接肽基因序列和人CD16b细胞膜锚定基因序列所拼接的与融合基因。