[发明专利]利用双链核酸检测器进行靶核酸检测的方法

说明书

本发明提供了利用双链核酸检测器进行靶核酸检测的方法，具体提供了一种检测样品中靶核酸的方法，所述方法包括将样品与CRISPR效应蛋白、gRNA(指导RNA)和核酸检测器接触，所述gRNA包括与所述CRISPR效应蛋白结合的区域和与靶核酸杂交的导向序列；检测由CRISPR效应蛋白切割所述核酸检测器产生的可检测信号，从而检测靶核酸，所述核酸检测器不与所述gRNA杂交；所述核酸检测器包括可以形成双链互补配对结构的核酸；所述CRISPR效应蛋白选自Mad7或LbCas12a。

技术领域

本发明涉及核酸检测领域，涉及利用双链核酸检测器进行靶核酸检测的方法，具体涉及利用Cas蛋白进行核酸检测的方法，所述检测方法中的检测器为双链核酸检测器。

背景技术

特异性检测核酸分子(Nucleic acid detection)方法具有重要的应用价值，例如病原体的检测，遗传病检测等。在病原体检测方面，由于每种病原体微生物都有其独一无二的特征核酸分子序列，因此可以开发出针对特定物种的核酸分子检测，也称为核酸诊断(NADs,nucleic acid diagnostics)，在食品安全、环境微生物污染检测，人体病原菌感染等领域具有重要义。

目前建立的特异性核酸分子检测通常需要分为两步，第一步是目的核酸的扩增，第二步是目的核酸检测。现有检测技术包括限制性核酸内切酶方法、Southern、Northern、斑点杂交、荧光PCR检测技术、LAMP环介导等温扩增技术、重组酶聚合酶扩增技术(RPA)等方法。

2012年之后，CRISPR基因编辑技术兴起，张锋团队基于RPA技术开发了一种以Cas13为核心的靶向RNA的新核酸诊断技术(SHERLOCK技术)，Doudna团队开发了一种以Cas12酶为核心的诊断技术(DETECTR技术),中国科学院上海植物生理生态研究所王金博士等也开发了一种基于Cas12的新型核酸检测技术(HOLMES技术)。基于CRISPR技术开发的核酸检测技术正在日益发挥重要作用。申请人基于Cas12i和Cas12j也开发了相应的核酸检测体系，例如，中国专利申请(CN111996236A，公开日：2020年11月27日)公开了基于Cas12i和Cas12j的核酸检测方法，但是，上述方法中所利用的检测器均是单链核酸；本申请对上述检测方法中的检测器进行了改进，提出了一种利用双链核酸作为检测器进行核酸检测的方法。

发明内容

本发明提供了一种基于CRISPR技术进行核酸检测的方法、组合物、系统和试剂盒，尤其提供了一种利用优化的核酸检测器进行靶核酸检测的方法、组合物、系统和试剂盒。

一方面，本发明提供了一种检测样品中靶核酸的方法，所述方法包括将样品与CRISPR效应蛋白、gRNA(指导RNA)和核酸检测器接触，所述gRNA包括与所述CRISPR效应蛋白结合的区域和与靶核酸杂交的导向序列；检测由CRISPR效应蛋白切割所述核酸检测器产生的可检测信号，从而检测靶核酸，所述核酸检测器不与所述gRNA杂交；

所述核酸检测器包括可以形成双链互补配对结构的核酸；所述CRISPR效应蛋白选自Mad7或LbCas12a。

所述Mad7记载在专利申请(CN111511906A，公开日期：20200807中)，在其他的实施方式中，所述Mad7还可以包括Mad7的突变体或直向同源物，例如，US10704033B1中记载的Mad7的直向同源物Mad7v1、Mad7v2、Mad7v3和Mad7v4，以及US10604746B1中记载的MAD7的突变体MAD70系列蛋白(US10604746B1的SEQ ID No.8、9、10或15所示)。

本发明中，所述核酸检测器包括可以形成双链互补配对结构的核酸；在一个实施方式中，所述核酸检测器为单链核酸，所述单链核酸具有反向重复序列，所述反向重组序列可以通过碱基互补配对形成双链互补配对结构；在其他的实施方式中，所述互补配对结构由双链核酸互补配对形成；在一个实施方式中，所述核酸检测器的核酸为双链核酸。所述单链核酸或双链核酸的核酸为DNA或RNA。