[发明专利]一种高纯度玻璃酸酶的制备工艺

权利要求书

1.一种高纯度玻璃酸酶的制备工艺，其特征在于：具体步骤如下，

(1)、玻璃酸酶粗品溶解：取玻璃酸酶粗品，用15-25倍纯化水溶解，搅拌1小时，2000-4000r/min离心，取上清，调PH至7.0，备用；

(2)、巴氏法消毒：取以上上清液，按每升体积加入100-300g蔗糖，用8M氢氧化钠调节PH至7.0，置50-70℃水浴箱中，搅拌保温8-12小时；转移至2-8℃环境中冷却，得冷却液；

(3)、PMB亲和层析去热原：将以上冷却液过PMB亲和层析柱，再用5倍柱床的0.15M NaACPH7.0洗脱，无菌收集洗脱流出液；

(4)、亲和层析梯度法纯化：将以上洗脱流出液经过亲和层析吸附，并用0.02M NaAC/HAC PH7.0的溶液洗涤，再用0.02M NaAC/HAC PH7.0以及0.02M NaAC/HAC-0.6M NaClPH7.0溶液采用梯度洗脱法进行在线洗脱，依据OD₂₈₀蛋白峰值，按亲和层析吸附剂的体积进行分段收集并测定各段玻璃酸酶的效价、蛋白，计算其比活，合并高纯度玻璃酸酶产品的收集液；

(5)、超滤浓缩、过滤：将以上收集液经10K超滤器浓缩至浓度为40万IU/ml，并用微孔滤膜除菌过滤，无菌收集滤液，即为玻璃酸酶无菌溶液；

(6)、冷冻干燥：玻璃酸酶无菌溶液倒入消毒的冻干盘内，采用-45℃预冷3-6h；干燥箱真空度≤30Mpa，25℃升华至产品干燥为止，即得高纯度玻璃酸酶；

所述PMB亲和层析柱的制备方法为，

(1)、取改性琼脂糖凝胶CL-4B 0.5-1.5L，用5-15L、0.5M的NaCl溶液滤洗，再用10L纯水洗涤，抽干，加纯水悬浮至1-2L，得悬浮液a；

(2)、将悬浮液a置于2-6℃环境冰浴，边搅拌边滴加50-150ml环氧氯丙烷滴加速度为15-25ml/min、100-300ml二甲亚砜滴加速度为20-30ml/min，滴加完毕后静置反应4-8h，产物用纯水滤洗3-5次，用纯水悬浮至1-2L，得悬浮液b；

(3)、取多粘菌素B 8-16g，溶解于200ml水中，调节PH至8.5，得多粘菌素B溶液；将其加入到悬浮液b中，保持PH8.5不变，23-27℃温度下搅拌10-14h，静置2h，产物先用5-15L、0.5M的NaCl溶液滤洗，再用10L纯水洗涤3-5次，按需求规格装柱，即得；

所述改性琼脂糖凝胶CL-4B的制备方法为，原料按重量份计算包括琼脂糖凝胶CL-4B80-90份、改性成分3-9份；

(1)、取改性成分浸渍于液氮中，低温冷冻10-20min，取出立即粉碎，分别过2000目、1000目、500目分子筛，混合，得预处理改性成分，备用；其中2000目、1000目、500目的质量比为3-7：2-4：1；

(2)、琼脂糖凝胶CL-4B以4-8℃/min升温至65-75℃，恒温2-6min，加入预处理改性成分，搅拌均匀，转移至模具中，20s内降至常温，20-60Mpa加压40-60s成型，得改性琼脂糖凝胶CL-4B粗品；

(3)、将改性琼脂糖凝胶CL-4B粗品置于5倍质量的溶剂中，300-400rpm转速搅拌1h，静置2h，搅拌静置循环6-10次，每两个循环更换溶剂，得改性琼脂糖凝胶CL-4B；

所述改性成分为质量比为1：1-3的N-(1,3-二甲基丁基)-N'-苯基对苯二胺、聚碳化二亚胺的混合物；所述溶剂为质量比为1：1：1的甲苯、苯、硫酸二甲酯的混合物；

所述微孔滤膜的制备方法为，原料按重量份计算包括铸膜液主料55-85份、有机溶剂60-120份、致孔剂3-9份、塑化剂0.5-1.5份；

(1)、制备铸膜液：将铸膜液主料与有机溶剂混合搅拌至完全溶解，升温至45-55℃，保温5-15min，1-3℃/min升温75-85℃，加入致孔剂，400～800r/min搅拌10-20min，转移至脱泡机中脱泡处理，冷却至常温，得铸膜液；

(2)、制备滤膜：通过刮涂或喷涂的方式将铸膜液均匀的涂覆在洁净的平板玻璃上，控制湿膜的厚度为220-360um，然后在常温状态下自然晾置1-3min，浸入15-25℃的水中进行相转化，浸泡0.5-1.5h，取出，先垂直挂沥至无滴水，再转移至烘箱中，30-40℃烘干，即得微孔滤膜；

所述有机溶剂为质量比为1-3：1的四氢呋喃、N,N-二甲基乙酰胺的混合溶液；所述塑化剂为磷酸二苯基异辛酯；

所述铸膜液主料的制备方法为，原料按重量份计算包括聚苯胺35-55份、聚醚酰亚氨20-40份、改性剂20-30份；将聚苯胺、聚醚酰亚氨放入研磨机中研磨粉碎至均匀颗粒，装入反应罐中，10-20℃/min升温至340-400℃，保温5-10min，自然降温至160-180℃，加入改性剂，再以1-3℃/min重新升温至340-400℃，保温反应5-10min，自然降温100-120℃，趁热用造粒机挤出造粒，研磨粉碎过200目筛网，即得；

所述改性剂的制备原料为质量比为1：6-10：2-6的1,5,7-三叠氮双环(4.4.0)癸-5-烯、胶木粉、芦荟提取物，将胶木粉与1,5,7-三叠氮双环(4.4.0)癸-5-烯混合，得胶木粉-1,5,7-三叠氮双环(4.4.0)癸-5-烯混合物备用；将芦荟提取物分散于5倍质量的水中，加入胶木粉-1,5,7-三叠氮双环(4.4.0)癸-5-烯混合物，升温至40-60℃，搅拌均匀，抽滤，滤渣干燥至恒温，超微粉碎至2000目即得；

所述致孔剂的制备原料按重量份计算包括聚乙二醇5-10份、聚丙二醇3-7份、二甲苯2-6份、纤维石膏10-20份，(1)、纤维石膏预处理：取纤维石膏粉碎，过50目筛网，浸泡于10倍质量、5-10％质量浓度的醋酸钠溶液中，时长5-10min，抽滤，滤渣用纯水洗涤3-5次，得纤维石膏粉；(2)、纤维石膏强化处理：将纤维石膏粉置于温度为50-70℃的真空干燥箱中烘至恒温，迅速转移至高温炉中，7-11℃/min升温至130-160℃，保温10min，2-4℃/min降至常温，升温-保温-降温循环3-5次，取出粉碎，过1000目筛，得强化纤维石膏微粉；(3)、制得致孔剂：将强化纤维石膏微粉与聚乙二醇、聚丙二醇、二甲苯共混，100-200rpm转速搅拌分散0.5-1.5h，即得；所述纤维石膏为竹炭纤维石膏或麦秆纤维石膏。