[发明专利]一种高纯度玻璃酸酶的制备工艺

说明书

本发明提供了一种高纯度医用级玻璃酸酶的制备工艺，采用亲和层析梯度法纯化，通过不同粒径的改性成分处理制得的改性琼脂糖凝胶CL‑4B作为凝胶载体，将多粘菌素B承载于其中，大幅提升了亲和层析柱的有效吸附量；超滤浓缩步骤中采用微孔滤膜进行除菌过滤，细菌截留率高，同时，针对目前微孔滤膜频繁使用易出现孔隙增大，截留量降低的问题，采用1,5,7‑三叠氮双环(4.4.0)癸‑5‑烯、胶木粉、芦荟提取物为原料的改性剂处理制备铸膜液，大幅提高了常规苯胺、聚醚酰亚氨制备的滤膜的拉伸强度，延长了滤膜的耐用性；同时针对拉伸强度提高导致抗冲击强度一般的问题，发明人通过研究改进致孔剂，在致孔效果不影响的情况下，拉伸强度和抗冲击强度也同时达到平衡。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高纯度玻璃酸酶的制备工艺。

背景技术

玻璃酸酶又名透明质酸酶，是从哺乳动物睾丸中提取的一种能水解玻璃黏多糖的酶，是一种白色或微黄色粉末，在水中易溶，在乙醇、丙酮或乙醚中不溶。无臭。稳定性较好，42℃持续加热60min活力不损失，100℃持续加热5min活力可保留80％。在低浓度的水溶液中较易失活，一般可用明胶或阿拉伯胶保护防止失活。Fe2+、Cu2+离子对酶有可逆抑制作用。Pb2+、Hg2+、Ni 2+、等离子对酶活性没有明显影响。在氯化钠(0.15mol/L)或硫酸鱼精蛋白的存在下，硫酸软骨素B(皮肤素)、硫酸类肝素、硫酸角质素、肝素钠及高浓度玻璃酸对玻璃酸酶的抑制作用可被逆转。

玻璃酸是存在于人体组织间基质中的粘多糖，能限制细胞外液的扩散。玻璃酸酶作用于玻璃酸分子中的葡萄糖胺键，使之水解和解聚，降低体液的粘度，使细胞间液易流动扩散，故可使局部积贮的药液、渗出液或血液扩散，加速药物吸收，减轻局部组织张力和疼痛，并有利于水肿、炎性渗出物的吸收、消散。

然而，随着国家药品标准的进一步提高，玻璃酸酶的质量标准也更加的严格。中国药典2010版规定玻璃酸酶酸度在4.5-7.5；干燥失重5.0％；酪氨酸含量0.1ug；玻璃酸酶效价≥300单位；细菌内毒素为每1单位玻璃酸酶中含内毒素的量应小于0.20EU。因此，如何开发获取高纯度医用级玻璃酸酶产品成了众多生物制品厂商的研究重点。

发明内容

本发明的第一目的：提供一种高纯度医用级玻璃酸酶的制备工艺；

本发明的另一目的：提供一种用于高纯度医用级玻璃酸酶的制备工艺中的PMB亲和层析柱；本发明的第三目的：提供一种用于高纯度医用级玻璃酸酶的制备工艺中的微孔滤膜；

本发明通过如下技术方案实现：一种高纯度医用级玻璃酸酶的制备工艺，具体为：

(1)、玻璃酸酶粗品溶解：取玻璃酸酶粗品，用15-25倍纯化水溶解，搅拌1小时，2000-4000r/min离心，取上清，调PH至7.0，上清液备用。

(2)、巴氏法消毒：取以上上清液，按每升体积加入100-300g蔗糖，用8M氢氧化钠调节PH至7.0，置50-70℃水浴箱中，搅拌保温8-12小时；转移至2-8℃环境中冷却，得冷却液。

(3)、PMB亲和层析去热原：将以上冷却液过PMB亲和层析柱，再用5倍柱床的0.15MNaAC PH7.0洗脱，无菌收集洗脱流出液。

(4)、亲和层析梯度法纯化：将以上洗脱流出液经过亲和层析吸附，并用0.02MNaAC/HAC PH7.0的溶液洗涤，再用0.02M NaAC/HAC以及0.02M NaAC/HAC-0.6M NaCl、PH7.0溶液采用梯度洗脱法进行在线洗脱，依据OD280蛋白峰值，按每CV(柱床)进行分段收集并测定各段玻璃酸酶的效价、蛋白，计算其比活，合并高纯度玻璃酸酶产品的收集液。

(5)、超滤浓缩、过滤：将以上收集液经10K超滤器浓缩至浓度为40万IU/ml，并用微孔滤膜除菌过滤，无菌收集滤液，即为玻璃酸酶无菌溶液。