[发明专利]一种无血清培养细胞的方法

说明书

本发明涉及生物技术领域，具体的，涉及一种无血清培养细胞的方法。本发明中，通过生物材料水溶液包裹细胞形成细胞高密度聚集的水凝胶结构，细胞个数与生物材料水溶液体积的比例在10⁵–10⁹个/mL范围内可以达到无血清培养细胞的效果，通过细胞自身分泌的活性成分可以实现水凝胶结构中细胞的正常生长增殖，细胞活率可达90%以上。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种无血清培养细胞的方法，该方法可以方便快捷进行无血清细胞培养，细胞生长正常。

背景技术

细胞培养领域中，在经历了天然培养基、合成培养基后，无血清培养基和无血清培养已成为热点发展方向之一。无血清培养细胞是一种不需要添加血清就可以维持细胞在体外较长时间生长繁殖的细胞培养方式。采用无血清培养可降低生产成本，简化分离纯化步骤，避免病毒污染造成的危害。现有无血清培养细胞的方法主要集中在开发无血清细胞培养基上，即不加动物血清，在基础培养基中加入细胞生长有效因子，激素等，其中，加入成份完全明确的或部分明确的血清替代成份，达到既能满足动物细胞培养的要求，又能有效克服使用血清所带来问题的目的。例如，CN102827810B“一种无动物源的脐血干细胞无血清培养基”，其中，公开了一种无动物源的无血清培养基，其必要组成为IMDM、L-谷氨酰胺、碳酸氢钠、重组人胰岛素、人转铁蛋白、重组人白蛋白、2-巯基乙醇、植物血凝素PHA、脂质、氨基酸、维生素、微量元素、IL-3、SCF、Fit3-L、IL-6、G-CSF，该无血清培养基化学成分明确、无动物源、无血清，培养细胞安全、理想，避免了掺杂动物成分和批次的不稳定性，培养脐血干细胞结果显示其细胞总数、细胞表型和分泌细胞因子均正常。为了实现无血清培养细胞，虽然无血清培养基具有组成明确、可重复性强、避免血清对细胞的毒性作用和血清源性污染风险等优点，但也存在制备工艺繁杂、成本较高、普适性低等不足之处。

另一方面，不同于常规二维细胞培养方式，通过细胞结团聚集的方式也可以实现无血清培养细胞。例如，CN100543131C“一种用于动物细胞无血清结团灌流培养的方法”，其中，公开了一种用于动物细胞无血清结团灌流培养的方法，该方法包括以下步骤：(1)工程细胞在无血清培养基的搅拌培养中驯化；(2)工程细胞在转瓶、方瓶和搅拌瓶的无血清培养基培养中初步结团；(3)细胞在反应罐中用超声-沉降双结合灌流系统进一步结团和进行灌流培养；(4)不定期抽去部分细胞，使罐内细胞保持合适的高密度，并可直接用以扩大生产。该方法虽然可以提高细胞的结团效率和灌流时细胞的截留效率，促使细胞在无血清培养基中高效增殖，但过程复杂、成本较高，而且细胞结团聚集不利于细胞间活性成分传输，不利于细胞长期培养和分离。

针对以上无血清培养细胞存在的不足之处，本发明通过生物材料包裹达到细胞高密度聚集的效果，细胞可以在无血清细胞培养液中生长增殖，简便快捷实现无血清培养细胞。

发明内容

本发明提供一种无血清培养细胞的方法。

一种无血清培养细胞的方法，其中，依次包括如下步骤：

(1)通过细胞计数板或细胞计数仪测定预培养细胞悬液中的细胞数，离心细胞悬液，细胞经离心聚集在离心管底部后，吸除上清液；

(2)将生物材料水溶液与细胞混合，吹打细胞直至与生物材料水溶液混合均匀，细胞均匀分散在生物材料水溶液中形成生物材料包裹细胞的三维结构；

(3)添加无血清细胞培养液浸没生物材料包裹细胞的三维结构，进行无血清培养细胞。

本发明一种无血清培养细胞的方法，其中，所述步骤(2)中生物材料包括天然生物材料或合成生物材料中的至少一种。

本发明一种无血清培养细胞的方法，其中，所述步骤(2)中天然生物材料包括壳聚糖及其衍生物、纤维素类材料、海藻酸盐及其衍生物、壳聚糖/甘油磷酸二钠混合物、淀粉类材料、血清白蛋白、明胶及其衍生物、鲱精蛋白、血纤蛋白原、胶原、肽类材料、木聚糖、透明质酸、鱼胶、角蛋白类、促凝血酶原激酶、还原角蛋白中的至少一种