[发明专利]一种布洛芬人工抗原检测探针的制备及其应用

说明书

本发明提供了一种布洛芬人工抗原检测探针及其制备方法和应用，该制备方法首次用酶为载体蛋白，制备同时具有免疫原性和酶催化活性的布洛芬人工抗原，以用于布洛芬的分析。将辣根过氧化物酶(HRP)作为载体蛋白，通过活化酯法制备了布洛芬的人工抗原，利用MALDI‑TOF‑MS快速测定了其偶联比。经验证，该人工抗原不仅具有与HRP一样的催化活性，还可以将其用于直接竞争酶联免疫分析法(ELISA)中实现对尿液中布洛芬的定性分析，扩大了其应用范围，为免疫分析提供了一种简单可行的新方法。本方法分析灵敏度高、速度快、仪器便宜，能够准确分析样品中的布洛芬含量。

技术领域

本发明涉及免疫分析领域，具体而言，涉及一种布洛芬人工抗原检测探针及其制备方法和应用。

背景技术

布洛芬一种重要的非甾体抗炎药，监测生物样品中的布洛芬含量，在对公共健康具有重要的作用。但目前的检测方法需要昂贵的仪器，复杂的样品前处理步骤、费时、高的检测限、特异性低或者需要毒性试剂。用于布洛芬检测的传统间接ELISA法需要其相应的抗体和二抗，因而其需要高昂的费用，同时需要冗长、费时的操作程序。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种布洛芬人工抗原检测探针，这种检测探针兼具免疫原和酶催化的双重性质，而且结构稳定、容易保藏。这种布洛芬人工抗原检测探针，检测布洛芬时操作简单、检测迅速且灵敏度高，能够对样品中很微量的布洛芬行有效检测。

本发明的第二目的在于提供一种布洛芬人工抗原检测探针的制备方法，制备方法步骤简单、反应条件不苛刻，容易实现，且该法所用到的溶剂对环境友好，适合工业大生产，能够对样品中布洛芬进行有效检测。

本发明的第三目的在于提供一种布洛芬人工抗原检测探针的应用，即用探针来检测待测样品中布洛芬的含量。检测布洛芬时，利用布洛芬人工抗原结合直接竞争ELISA法完成对样品中布洛芬中的定性分析，操作简单、检测迅速且灵敏度高。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种布洛芬人工抗原检测探针的制备方法，其包括：

步骤Ⅰ：将布洛芬与N,N'-二环己基碳酰亚胺(DCC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)混合，搅拌过夜。

步骤Ⅱ：将步骤Ⅰ反应液于离心后，冰浴环境下将上清液缓慢加入到与DMF体积比2：5HRP溶液中，室温搅拌12h。随后将反应液离心，透析，即得到布洛芬人工抗原，放于4℃下保存备用，随后进行布洛芬人工抗原偶联比测定。

一种布洛芬人工抗原检测探针的应用，其包括：

步骤a：用辣根过氧化物酶为载体蛋白，通过布洛芬与HRP偶联物的质谱图，计算出偶联比；布洛芬人工抗原保留与HRP一样的催化活性，即成功制备同时具有免疫原性和酶催化活性的布洛芬人工抗原；

步骤b：利用布洛芬人工抗原结合直接竞争ELISA法完成对样品中布洛芬中的定性分析。先将布洛芬抗体包被于酶标板上，过夜，洗涤后加入封闭液，洗涤备用；

步骤c：人工抗原可以和尿液样品中布洛芬竞争地与酶标板上的抗体结合，将样品和布洛芬人工抗原检测探针和中加入四甲基联苯胺溶液，静置12-18min进行显色，随后加入H₂SO₄终止显色，于445-455nm处检测吸光度，采用标准曲线法得出所述待测样品中布洛芬的含量。与现有技术相比，本发明的有益效果为：

布洛芬人工抗原检测探针的制备方法中，采用用辣根过氧化物酶为载体蛋白；随后利用N,N'-二环己基碳酰亚胺(DCC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)进行活化；再然后将HRP溶液与之室温搅拌12h得到兼具免疫原和酶催化的双重性质的布洛芬人工抗原。这种制备方法简单、反应条件温和，容易实现，适合工业大生产。

用布洛芬人工抗原检测探针来检测样品中的布洛芬的原理是：