[发明专利]一种利用研究型正置显微成像系统定量分析斑马鱼黑色素的方法

说明书

本发明属于生物测量技术领域，具体涉及一种利用研究型正置显微成像系统定量分析斑马鱼黑色素的方法；该方法主要是对斑马鱼体表进行成像，从而获得斑马鱼图像文件，然后对图像文件进行图像的相关性计算处理，即捕获清晰斑马鱼体表的黑色素分布图像，将其进行相关性计算处理来统计斑马鱼显微成像下体表黑色素的面积，即得斑马鱼黑色素的数据。本发明方法对实验对象本身不产生任何伤害，属于无接触测量，减少外界因素的影响，有效提高研究数据的可靠性。

技术领域

本发明属于生物测量技术领域，一种具体涉及显微成像系统和生物活体成像的斑马鱼体表黑色素定量的方法。

背景技术

斑马鱼具有便于大规模筛选、饲养方便、传代时间短、价格低廉并且斑马鱼的体表上有黑色色素，无需复杂的实验程序即可简单观察色素沉着过程等优势，而斑马鱼体表的黑色素的改变可用作美白祛斑原料的功效评价，因此斑马鱼身体上的黑色素统计在研究以及筛选具有美白成分的原料极为重要。目前关于斑马鱼体表黑色素的定量方法通常采用吸光度光谱法或者荧光光谱法，这些方法步骤繁琐、主观因素影响大，并且很容易对实验造成干扰，引起黑色素数据不准确。

1、吸光度光谱法用于黑色素的定量：该方法是使用约100个受精后9到48h的斑马鱼胚胎，在蛋白质提取液中进行超声处理。离心后，将沉淀在100℃的1N NaOH中溶解10分钟。将获得的上清液在波长为490nm的吸收光谱处进行测量。该方法1996年由Buscà R,Bertolotto C,Ortonne JP,Ballotti R.发表在《生物杂志化学》(JOURNAL OF BIOLOGICALCHEMISTRY)上：题目为“Inhibition of the Phosphatidylinositol 3-Kinase/p70S6-Kinase Pathway Induces B16 Melanoma Cell Differentiation”.期刊号为：31763-32482DEC 1996.

2、荧光光谱法用于黑色素的定量：该方法使用十个胚胎，从48hpf到120hpf，黑色素的产量稳定增长。黑色素受到在碱性过氧化氢溶液中加热的氧化条件下发出荧光，黑色素的量在三个选定的时间点内收集。该方法2016年由Fernandes B,Matamá T,D,Gomes A,Cavaco-Paulo A.发表在《色素细胞与黑色素瘤研究》(PIGMENT CELLMELANOMARESEARCH)上：题目为“Fluorescent quantification of melanin”期刊号为：603-714NOV2016.

但是，这些方法操作繁琐步骤多，而且对斑马鱼具有破坏性且主观因素影响大。从这几点来看本发明采取的定量斑马鱼体表黑色素的方法更加简便，给美白化妆品领域的研究带来更多的便利。

发明内容

针对上述不足，本发明为斑马鱼黑色素的定量提供一种无接触式、操作简便、数据可靠的定量分析斑马鱼黑色素的方法。

为此，本发明提供的技术方案是这样的：

一种利用研究型正置显微成像系统定量分析斑马鱼黑色素的方法，依次包括下述步骤：

1)对被测量的斑马鱼进行可视化处理，使用研究型正置显微镜捕获斑马鱼图像，得到一组斑马鱼体表明敞图像；

2)然后利用Python和open CV的程序对该组图像进行相关性计算处理，对斑马鱼原始图像进行二值化处理转换为灰度图像，再将图像划分为多个矩形；统计每一张图像上斑马鱼轮廓内的矩形面积S_{矩(斑马鱼)}以及斑马鱼轮廓内黑色素所占的矩形面积S_{矩(黑色素)}；按式(1)计算每一组斑马鱼的黑色素面积，得到一组数据，即为斑马鱼的黑色素面积数据，

其中S_{矩(斑马鱼)}表示图像中斑马鱼轮廓的矩形面积，S_{矩(黑色素)}表示图像上斑马鱼轮廓中黑色素的面积。