[发明专利]一种Shank1通过与MDM2相互作用调节Klotho泛素化的机制研究

权利要求书

1.一种Shank1通过与MDM2相互作用调节Klotho泛素化的机制研究，其特征在于：包括Shank1在非小细胞肺癌(NSCLC)中的作用以及对Klotho(KL)的影响研究和Shank1/mdm2/Klotho三者之间相互作用研究，具体包括以下内容：

A Shank1在非小细胞肺癌(NSCLC)中的作用以及对Klotho的影响研究

A-1 NSCLC中的Shank1上调

利用免疫组织化学分析方法检测了NSCLC组织及其邻近正常肺组织中Shank1的蛋白水平，结果显示，100例NSCLC肿瘤组织中，50例显示Shank1表达异常，明显高于相应的邻近正常肺组织；

利用蛋白质印迹分析(Western blot)法检测了10对NSCLC组织及相应的邻近正常肺组织中的蛋白表达，结果显示，与相应的正常肺组织样品相比，Shank1在肿瘤组织中的表达升高；

应用Kaplan-Meier分析，根据mRNA表达将高危组与低风险组进行了分化，结果显示，高Shank1表达的NSCLC患者的总生存率低于低Shank1表达者；

A-2 Shank1的敲除抑制NSCLC细胞的迁移、侵袭和诱导凋亡

对转染Shank1-shRNA(sh-SHANK1)或Shank1-shRNA(NC)的A549和H1299细胞进行了transwell检测，结果显示Shank1的下调显著减少了移植和侵袭性A549和H1299细胞的数量，表明Shank1是NSCLC运动的一个正向调节因子；

利用流式细胞术检测细胞凋亡以确定shRNA对细胞死亡的抑制作用，结果显示，对照Shank1-shRNA(NC)或sh-Shank1转染A549细胞凋亡细胞比例分别为4.17％和9.42％，提示sh-SHANK1增殖细胞数量的减少，确实是细胞死亡所致，利用同样的方法转染H1299细胞的结果相同；

其中，Shank1-shRNA(sh-SHANK1)是可以特异性降低SHANK表达的发卡RNA，Shank1-shRNA(NC)是不能降低任何基因表达的阴性对照；

A-3 Shank1过表达以剂量依赖性方式降低Klotho(KL)的蛋白表达

采用Western blot方法对6例NSCLC患者Shank1和KL蛋白表达进行了相关性研究，结果显示，4例肿瘤组织Shank1高表达，KL低表达，2例肿瘤组织Shank1低表达，KL高表达，表明Shank1在肺癌组织中的表达与KL的表达呈显著负相关；

B Shank1/mdm2/Klotho三者之间相互作用研究

B-1 Shank1与KL相互作用，增加KL的泛素化

通过转染和免疫共沉淀实验，发现Shank1与A549细胞中的KL具有明确的相互作用，利用Shank1和KL抗体检测内源性Shank1和KL的定位，结果表明Shank1与KL部分共定位，Shank1显著增加KL的泛素化；

B-2 MDM2与KL相互作用，增加KL的泛素化

利用MDM2-HA和Flag-KL质粒转染A549细胞，在用FLAG抗体免疫沉淀KL后，通过使用MDM2-HA抗体的免疫印迹分析观察到KL与MDM2的结合，在MDM2-HA的免疫沉淀和抗Flag抗体的免疫印迹后，也检测到Flag-KL和MDM2-HA之间的复合物，再用MDM2和KL抗体检测内源性MDM2和KL的定位，结果表明MDM2与KL部分共定位；

再对A549细胞进行内源性KL/MDM2免疫共沉淀测定，裂解物用抗MDM2抗体免疫沉淀，发现KL在内源性水平下与MDM2共免疫沉淀，证实MDM2/KL在体内外均能形成复合物，MDM2可以降低KL的表达，并且这种作用可以被MG132(蛋白酶体抑制剂)阻断；

将表达MDM2基因wt(HA标记)和DN突变体(C462A)的构建体分别转染A549细胞，发现MDM2-wt可以显著增加KL的泛素化，而MDM2的DN突变体(C462A)不能起到同样的作用，上述结果表明MDM2还可以作为KL的E3泛素连接酶，Shank1可以调节它们之间的相互作用；

B-3 Shank1/KL/MDM2可形成复合物

在用特异性抗体免疫沉淀MDM2后，通过免疫印迹法以及KL的免疫沉淀试验结果表明，Shank1基因敲除可以显著降低KL和MDM2之间的相关性，KL的表达不受Shank1的影响，Shank1的外源过表达可以增加KL和MDM2之间的相互作用，Shank1的沉默可以减少这种相互作用，而MDM2的表达水平不能影响KL和Shank1之间的关联；

进行内源性MDM2/KL免疫共沉淀试验后发现，Shank1在内源性水平下也与KL共免疫沉淀，沉默Shank1可以削弱A549细胞中MDM2和KL之间的相互作用；

通过免疫共沉淀分析，发现Shank1不能影响p53和MDM2之间的关联，此外，Shank1还与Mdm2/KL复合物有关，并影响复合物的形成，上述结果表明，Shank1/KL/MDM2可以形成一个复合物，Shank1影响复合物的形成。