[发明专利]CAR-γδT细胞的制备方法

权利要求书

1.一种CAR-γδT细胞的制备方法，其特征在于，包括：

1)将PBMC在培养基中培养2～4天，定义起始培养的第0天为D0；

2)将细胞转移到包被有RetroNectin和负载有用于表达嵌合抗原受体的核酸的慢病毒的培养容器中培养细胞8h～24h；

3)重复步骤2)；

4)换液，将上一步培养得到的细胞接种到新的培养容器中培养；

5)在D7～D9分离纯化CAR-γδT细胞继续培养；

6)在D12～D16收获CAR-γδT细胞；

在上述步骤1)中，所用培养基由基础培养基以及附加组分组成；

所述附加组分由7％～13％(v/v)FBS、IL2 400IU/mL～600IU/mL、IL21 7ng/mL～13ng/mL以及双膦酸盐3μM～7μM组成，上述各组分的浓度是指各组分在所述培养基中的终浓度；

所述基础培养基为GT-T551 H3培养基；

所述包被有RetroNectin和负载有用于表达嵌合抗原受体的核酸的慢病毒的培养容器通过如下方法制备：

a)将RetroNectin加入培养容器中，于2℃～6℃过夜包被8～16小时；

b)去除未包被上的RetroNectin，加入封闭液封闭培养容器；

c)加入所述慢病毒，于30℃～34℃，1200g～1800g离心1.5h～2.5h，再去除未包被上的慢病毒。

2.根据权利要求1所述的CAR-γδT细胞的制备方法，其特征在于，所述双膦酸盐包括唑来膦酸、依替膦酸、伊班膦酸、帕米膦酸、阿仑膦酸、利塞膦酸、米罗磷酸中的一种或多种。

3.根据权利要求1所述的CAR-γδT细胞的制备方法，其特征在于，步骤2)中，在D3将细胞转移到包被有RetroNectin和负载有用于表达嵌合抗原受体的核酸的慢病毒的培养容器中培养细胞8h～24h。

4.根据权利要求1～3任一项所述的CAR-γδT细胞的制备方法，其特征在于，步骤1)中，细胞的接种密度为(2～3)×10⁶个细胞/mL。

5.根据权利要求1～3任一项所述的CAR-γδT细胞的制备方法，其特征在于，步骤2)～5)中，培养细胞时，细胞的接种密度均为(1～2)×10⁶个细胞/mL。

6.根据权利要求1～3任一项所述的CAR-γδT细胞的制备方法，其特征在于，步骤5)中，所述分离纯化γδT细胞的方法为使用特异性结合TCRγ/δ的固相富集γδT细胞，并洗去杂质。

7.根据权利要求6所述的CAR-γδT细胞的制备方法，其特征在于，所述固相为磁珠。