[发明专利]CAR-γδT细胞的制备方法

说明书

本发明涉及一种CAR‑γδT细胞的制备方法。该方法包括：1)将PBMC在培养基中培养2～4天，定义起始培养的第0天为D0；2)将细胞转移到包被有RetroNectin和负载有用于表达嵌合抗原受体的核酸的慢病毒的培养容器中培养细胞8h～24h；3)重复步骤2)；4)换液，接种到新的培养容器中培养细胞；5)在D7～D9分离纯化γδT细胞继续培养；6)在D10～D24收获γδT细胞；在上述步骤1)中，所用培养基包括基础培养基以及附加组分；所述附加组分包括：5％～15％(v/v)FBS、IL2 200IU/mL～800IU/mL、IL21 1ng/mL～20ng/mL以及双膦酸盐1μM～10μM。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种CAR-γδT细胞的制备方法。

背景技术

目前CAR T细胞在治疗肿瘤方面取得重大的进展，尤其是CD19 CAR T细胞在治疗B细胞恶性血液瘤上取得令人鼓舞的成绩。目前的大多数CAR T临床试验是使用病人自身的T细胞进行改造，因此T细胞的质量和数量的下降以及制备自体CAR T细胞产品的时间和费用提高都成为阻碍CAR T细胞治疗发展的重要因素。所以，通用型CAR T细胞产品不仅能提高CAR T细胞的质量和数量，还能节省生产的时间和费用。另外，传统的CAR T是使用αβT细胞进行改造，αβT细胞是依赖HLA识别肿瘤相关抗原，如果使用αβT细胞作为通用型CAR T细胞产品的细胞类型，很可能导致移植物抗宿主病(GVHD)。因此，通用型CAR T细胞的细胞类型选择尤为重要。

γδT在循环T细胞中占1％-5％，虽然所占的比例比较低，但对来自39个恶性肿瘤的约18.000个人类肿瘤表达特征的荟萃分析表明，肿瘤内γδT细胞的表达是对生存率最有利的预后指标之一。这使得γδT细胞是用于CAR治疗的一个非常有吸引力的细胞类型。而事实上，各种研究已经表明，γδCAR T细胞是完全能够裂解特异性肿瘤靶细胞。

目前，针对嵌合抗原受体修饰的γδT细胞的制备和培养报道很少，扩增和修饰效率不尽人意。CAR修饰的时机，扩增收获的时间等，都需要进一步探索。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明涉及一种CAR-γδT细胞的制备方法，包括：

1)将PBMC在培养基中培养2～4天，定义起始培养的第0天为D0；

2)将细胞转移到包被有RetroNectin和负载有用于表达嵌合抗原受体的核酸的慢病毒的培养容器中培养细胞8h～24h；

3)重复步骤2)；

4)换液，接种到新的培养容器中培养细胞；

5)在D7～D9分离纯化γδT细胞继续培养；

6)在D10～D24收获γδT细胞；

在上述步骤1)中，所用培养基包括基础培养基以及附加组分；

所述附加组分包括：5％～15％(v/v)FBS、IL2 200IU/mL～800IU/mL、IL211ng/mL～20ng/mL以及双膦酸盐1μM～10μM。

可选的，如上所述的CAR-γδT细胞的制备方法，所述附加组分包括：

7％～13％(v/v)FBS、IL2 400IU/mL～600IU/mL、IL21 7ng/mL～13ng/mL以及双膦酸盐3μM～7μM。

可选的，如上所述的CAR-γδT细胞的制备方法，所述双膦酸盐包括唑来膦酸、依替膦酸、伊班膦酸、帕米膦酸、阿仑膦酸、利塞膦酸、米罗磷酸中的一种或多种。

可选的，如上所述的CAR-γδT细胞的制备方法，所述基础培养基为GT-T551H3培养基。