[发明专利]一种棒状杆菌质粒复制子的改造方法及其产品

权利要求书

1.一种改造的棒状杆菌质粒复制子，其特征在于：所述棒状杆菌质粒复制子，以SEQ IDNo.1所示谷氨酸棒杆菌LP-6（Corynebacteriumglutamicum LP-6）中野生型棒杆菌质粒pGA1的最小复制子核苷酸序列，即片段1，为出发序列，将复制蛋白Rep的325位异亮氨酸突变为苏氨酸、398位丝氨酸变为同义密码子，通过构建重组菌、表达纯化，即得所述改造的棒状杆菌质粒复制子pGA1-Rep-I325T/S398。

2.如权利要求1所述改造的棒状杆菌质粒复制子，其特征在于：所述棒状杆菌质粒复制子，包括，

以SEQ ID No.1所示核苷酸序列为出发序列，将复制蛋白Rep的325位异亮氨酸突变为苏氨酸ACC、398位丝氨酸变为同义密码子丝氨酸CAU。

3.如权利要求1或2所述改造的棒状杆菌质粒复制子，其特征在于：所述棒状杆菌质粒复制子pGA1-Rep-I325T/S398其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

4.权利要求1~3中任一所述的棒状杆菌质粒复制子的改造方法，其特征在于：所述改造方法，包括，

以质粒pEC-XK99E为模版，设计引物Replicon_F、Replicon_R，通过PCR得到pEC-XK99E质粒中的棒状杆菌pGA1长度为1696bp的最小复制子区，即片段1；将片段1做琼脂糖凝胶电泳，回收正确分子量的琼脂糖凝胶条带，测定浓度后备用；

对片段1设计引物Replicon_F、355_R、355_F、575_R、575_F、Replicon_R，进行突变，将355位点由G突变为A得到片段2，355位点由G突变为A且575位点由T突变为C得到片段3，355位点由G突变为A得到片段4，片段2~4序列为SEQ ID NO.9~11；

其中，所述引物Replicon_F、Replicon_R的核苷酸序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示；所述355_R、355_F、575_R、575_F的核苷酸序列如SEQ ID NO.5~SEQ ID NO.8所示；

将片段2、3进行重叠PCR，引物为Replicon_F、575_R，得到片段5，序列为SEQ ID NO.12；

将片段4、5进行重叠PCR，引物为Replicon_F、Replicon_R，得到片段6，序列为SEQ IDNO.13；

以pEC-XK99E质粒为模版，通过PCR获得除pGA1复制子外的线性载体，且与该复制子有25bp及以上的同源序列；设计引物为Plasmid_F和Plasmid_R，核苷酸序列如SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16所示； 获得的长度为5322bp的线性载体片段19，序列如SEQ ID NO.19所示；

片段19与片段6进行同源重组，连接产物转化大肠杆菌JM109，转接培养后获得带有目的突变复制子的组成质粒：改造棒状杆菌质粒复制子pEC-XK99E -Rep-T/S。

5.如权利要求4所述的棒状杆菌质粒复制子的改造方法，其特征在于：所述琼脂糖凝胶电泳条件为170 v，电泳时间为10~15 min。

6.如权利要求4所述的棒状杆菌质粒复制子的改造方法，其特征在于：所述回收正确分子量，所述分子量即最小复制子的分子量1696bp。

7.如权利要求4所述的棒状杆菌质粒复制子的改造方法，其特征在于：所述设计引物Plasmid_F和Plasmid_R，其中，引物Plasmid_F和Plasmid_R的核苷酸序列如SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16所示。

8.如权利要求4所述的棒状杆菌质粒复制子的改造方法，其特征在于：所述同源重组，重组条件为片段19与片段6的浓度比例为1:3，50℃反应30 min。

9.如权利要求4所述的棒状杆菌质粒复制子的改造方法所得到的改造棒状杆菌质粒复制子pEC-XK99E -Rep-T/S，其特征在于：所述改造棒状杆菌质粒复制子pEC-XK99E -Rep-T/S，图谱如图3所示，其突变后拷贝数为野生型复制子的质粒的8倍。