[发明专利]一种棒状杆菌质粒复制子的改造方法及其产品

说明书

本发明基于pEC‑XK99E中的pGA1棒杆菌复制子这一在谷氨酸棒杆菌中拷贝数约为30的低拷贝质粒复制子，将复制蛋白Rep的325位异亮氨酸突变为苏氨酸、398位编码丝氨酸的氨基酸变为同义密码子，成功获得了一种可以提高棒杆菌质粒拷贝数的复制子pGA1‑Rep‑I325T/S398。将该复制子用于高拷贝质粒的构建，携带有pGA1‑Rep‑I325T/S398复制子的质粒pEC‑XK99E‑Rep‑T/S在谷氨酸棒杆菌中复制后，通过质粒体外抽提证实增加了菌体中质粒的数量。构建pEC‑XK99E‑EGFP‑Rep‑T/S质粒，通过测定不同菌体量下的荧光值，与为突变质粒相比荧光量增加三倍即改造后的质粒提高了蛋白的表达量。同时通过荧光定量PCR手段，测定突变后拷贝数为野生型复制子的质粒的8倍约为245。

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种改造的棒状杆菌质粒复制子及其产品。

背景技术

谷氨酸棒杆菌如今常使用的质粒均为棒状杆菌/大肠杆菌的穿梭质粒，其在大肠杆菌中的质粒拷贝数是在谷氨酸棒杆菌中5-6倍。所以外源蛋白通过穿梭质粒在谷氨酸棒杆菌的表达仍有较大的进步空间，构建一个高拷贝的可以在谷氨酸棒杆菌中使用的穿梭质粒很有意义。

目前已经从谷氨酸棒杆菌分离出的内源质粒根据复制方式和复制蛋白的相似性,它们被分类成多个棒杆菌质粒家族:pBL1、pCG1、pSR1以及pGA1家族均采用滚环复制。已有专利报道改造pXMJ19质粒的pBL1复制子可以提高其在谷氨酸棒杆菌中的拷贝数，但该质粒有复制分离不稳定的情况存在。pEC-XK99E 质粒拥有pGA1复制子在谷氨酸棒杆菌中采用滚环复制，拷贝数为30左右。在大多数情况下，革兰氏阳性菌中小的滚环复制的质粒的稳定维持是通过其高拷贝数实现的，并且不需要特定的分配机制。然而，当质粒拷贝数较小的情况下会出现分离不稳定，证明质粒拷贝数与分离稳定性呈正相关。pEC-XK99E中的per(positive effector of replication)蛋白可以调控细胞获得最佳数量的质粒拷贝，研究表明per对pGA1拷贝数的正效应可能是由于它与ctRNA相互作用，从而降低了ctRNA对pGA1基因表达的负面影响。并有实验表明，当pEC-XK99E与 pXMJ19在同一菌中表达时可以增加pXMJ19的拷贝数。因此，提高pEC-XK99E 质粒的拷贝数对提高谷氨酸棒杆菌外源蛋白表达，稳定穿梭质粒具有正向意义。

在本发明中，使用棒状杆菌/大肠杆菌穿梭质粒pEC-XK99E为基础，对其棒状杆菌复制子pGA1中的复制蛋白(Rep)进行定点突变，并使用报告基因验证了改造后质粒在复制、转录水平对异源蛋白表达的提高。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。

因此，本发明的目的是，克服现有技术中的不足，提供了一种改造的棒状杆菌复制子及其产品。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种改造的棒状杆菌复制子，其特征在于：包括，

所述棒状杆菌质粒复制子，以SEQ ID No.1所示Corynebacterium glutamicumLP-6(谷氨酸棒杆菌LP-6)中野生型棒杆菌质粒pGA1的最小复制子氨基酸序列，即片段1，为出发序列，将复制蛋白Rep的325位异亮氨酸突变为苏氨酸、 398位丝氨酸变为同义密码子，通过构建重组菌、表达纯化，即得所述改造的棒状杆菌质粒复制子pGA1-Rep-I325T/S398。

作为本发明改造的棒状杆菌质粒复制子的一种优选方案，其中：所述棒状杆菌质粒复制子，包括，