[发明专利]基于等温扩增技术鉴定环境中4种葡萄球菌的引物及检测试剂盒和应用

权利要求书

1.一种基于等温扩增技术鉴定环境中4种葡萄球菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）将环境样品经裂解后，收集的上清作为模板，用引物组进行等温扩增和高分辨率溶解曲线分析，得到扩增产物；

所述引物组包括扩增金黄色葡萄球菌的引物、扩增沃氏葡萄球菌的引物、扩增表皮葡萄球菌的引物和扩增头状葡萄球菌的引物；

所述扩增金黄色葡萄球菌的引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的反向引物；

所述扩增沃氏葡萄球菌的引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的反向引物；

所述扩增表皮葡萄球菌的引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示的反向引物；

所述扩增头状葡萄球菌的引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示的反向引物；

所述高分辨率溶解曲线分析的反应程序如下：95℃，60s；40℃，60s；75℃，1s；按照0.07℃/s的升温速度加热至98℃，持续1s；

2）将所述扩增产物经检测，检测结果与阳性对照C中各片段比对，当得到一致片段时，判断环境样品中含有对应种类的葡萄球菌；

阳性对照C中4种葡萄球菌的溶解曲线结果如下：金黄色葡萄球菌Tm峰值范围为83.6±1℃，表皮葡萄球菌Tm峰值范围为82.6±1℃，头状葡萄球菌Tm峰值范围为82.5±1℃，沃氏葡萄球菌Tm峰值范围为83±1.5℃；

所述阳性对照C包括金黄色葡萄球菌的扩增片段、沃氏葡萄球菌的扩增片段、表皮葡萄球菌的扩增片段和头状葡萄球菌的扩增片段；

所述金黄色葡萄球菌的扩增片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；

所述沃氏葡萄球菌的扩增片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；

所述表皮葡萄球菌的扩增片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示；

所述头状葡萄球菌的扩增片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述等温扩增的反应程序为39℃下扩增30min。

3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述等温扩增的反应体系为20μL：

recA重组酶蛋白 2~3μg

SSB 蛋白 1.5~2μg

Bsu DNA 聚合酶 0.5~1μg

2×反应缓冲液 10μL

10μM正向引物/反向引物 0.8μL/0.8μL

5×SYBR Green I 0.4μL

模板 2μL

ddH₂O 补足至20μL。

4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述裂解用试剂包括裂解液A；

所述裂解液A为含体积百分含量1%的Triton X-100的浓度10mM、pH 8.0的Tris-HCl溶液；

所述等温扩增用试剂包括反应液B；

所述反应液B为每18μL体系含有以下成分：recA重组酶蛋白2~3μg、SSB蛋白1.5~2μg、Bsu DNA 聚合酶 0.5~1μg、2×反应缓冲液 10μL、5×SYBR Green I 0.4μL和余量的ddH₂O。

5.根据权利要求1~4任意一项所述方法，其特征在于，所述环境样品中单种葡萄球菌的基因组DNA浓度不低于0.6pg/μL。