[发明专利]基于等温扩增技术鉴定环境中4种葡萄球菌的引物及检测试剂盒和应用

说明书

本发明提供了基于等温扩增技术鉴定环境中4种葡萄球菌的引物及检测试剂盒和应用，属于分子生物检测技术领域。基于等温扩增技术鉴定环境中4种葡萄球菌的引物组，包括扩增金黄色葡萄球菌、沃氏葡萄球菌、表皮葡萄球菌和头状葡萄球菌的引物。本发明还提供了一种用于鉴定环境中葡萄球菌的试剂盒，包含所述引物组。本发明检测环境中葡萄球菌时无需对样品中细菌培养、DNA提取以及测序等多步复杂操作，可对直接从环境采样的样品进行检测，简便快速成本低；检测耗时短，同时通过基于pheS特征序列设计特异引物，可对环境中金黄色葡萄球菌、沃氏葡萄球菌、表皮葡萄球菌以及头状葡萄球菌进行快速检测与鉴定，且具有较高的检测灵敏度。

技术领域

本发明属于分子生物检测技术领域，具体涉及基于等温扩增技术鉴定环境中4种葡萄球菌的引物及检测试剂盒和应用。

背景技术

葡萄球菌属于革兰氏阳性菌，是最常见的化脓性球菌，机体抵抗力低的老年、孕妇、新生儿等最易受到葡萄球菌侵染，引起天泡疮、结膜炎、脓毒血症等。此外，葡萄球菌还可在家禽中引起传染病，如脚垫肿、脐炎和葡萄球菌性败血症等，给养禽业造成较大的损失。

苯丙氨酰-tRNA合成酶α亚基基因(pheS)在同种菌株中具有高度的同质性，在不同种菌株中该基因序列相似性较差，是一种快速进化的基因。有研究表明，pheS基因可作为环境菌种鉴定的可靠工具，是检测菌种的有效筛选方法。

等温扩增技术是近年来发展起来的新型核酸扩增技术，该技术可以在恒定温度下快速有效地扩增核酸序列。与需要复杂的热循环以介导变性、退火和随后的延伸的PCR方法相比，等温扩增可以在恒温条件下利用重组酶、单链结合蛋白、DNA聚合酶实现对双链DNA的解链、复性和延伸，5~30分钟就可完成DNA扩增，操作简单，反应时间短，可用于对细菌的快速检测。

目前，还没有以pheS为靶基因，利用等温扩增技术同时对环境葡萄球菌属内多种细菌鉴定的方法，现有方法主要是利用PCR技术对金黄色葡萄球菌的鉴定，鉴定种类少，耗时长，技术要求高，不利于推广。因此，基于pheS特征序列，提供一种利用等温扩增技术鉴定环境4种葡萄球菌的引物和方法具有十分重要的意义。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于等温扩增技术鉴定环境中4种葡萄球菌的引物及检测试剂盒和应用。

本发明提供了一种基于等温扩增技术鉴定环境中4种葡萄球菌的引物组，包括扩增金黄色葡萄球菌的引物、扩增沃氏葡萄球菌的引物、扩增表皮葡萄球菌的引物和扩增头状葡萄球菌的引物；

所述扩增金黄色葡萄球菌的引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的反向引物；

所述扩增沃氏葡萄球菌的引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的反向引物；

所述扩增表皮葡萄球菌的引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示的反向引物；

所述扩增头状葡萄球菌的引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示的反向引物。

本发明提供了一种基于等温扩增技术鉴定环境中4种葡萄球菌的试剂盒，包括所述引物组。

优选的，所述试剂盒包括裂解液A和反应液B；

所述裂解液A为含体积百分含量1%的Triton X-100的浓度10mM、pH 8.0的Tris-HCl溶液；

所述反应液B为每18μL体系含有以下成分：recA重组酶蛋白2~3μg、SSB蛋白1.5~2μg、Bsu DNA 聚合酶 0.5~1μg、2×反应缓冲液 10μL、5×SYBR Green I 0.4μL和余量的ddH₂O。