[发明专利]一种多主棒孢菌分生孢子质量的测定方法

说明书

本发明公开了一种多主棒孢菌分生孢子质量的测定方法。所述测定方法包括如下步骤：将供试多主棒孢菌菌株进行活化和扩繁，利用粘附材料粘取多主棒孢菌分生孢子，利用差值法得到多主棒孢菌孢子粉的质量；配制多主棒孢菌分生孢子悬浮液；吸取悬浮液并滴加至血球计数板的表面，在光学显微镜下统计计数区多主棒孢菌分生孢子的数量，按照式1得到单个孢子的质量。本发明利用分析天平对孢子粉的质量进行称量，操作简单，无需特殊仪器设备，适用于绝大多数真菌物种；在光学显微镜下利用血球计数板定量计数区观察到的孢子个数，不仅能有效解决真菌孢子个体微小，肉眼无法直接计数的问题，而且仅对计数区的孢子个数进行统计，避免了对全部样品个数进行统计耗时、费力的过程。

技术领域

本发明涉及一种多主棒孢菌分生孢子质量的测定方法，属于微生物技术领域。

背景技术

多主棒孢菌Corynespora cassiicola是一种世界性真菌，在中国、美国、荷兰、日本等57个国家普遍发生。该菌寄主范围非常广泛，可侵染90科252属349种作物，主要包括蔬菜、水果、花卉、谷物、林木等，其中对橡胶、棉花、大豆等经济作物，以及黄瓜、番茄、豇豆等蔬菜的危害最为严重。2005年以来，我国蔬菜棒孢叶斑病每年发生面积超过1000万亩，经济损失超过50亿元。尤其是黄瓜棒孢叶斑病，至今已遍及北京、山东、辽宁等19个省市区，田间发病率一般为10％～25％，严重时可达60％～70％，甚至100％，对产业发展构成严重威胁。

空气传播是造成病原真菌广寄主和宽地域分布的根本原因，是导致病害短时间、大面积暴发的重要途径。多主棒孢菌侵染植株后，在发病部位表面产生病征(分生孢子梗和分生孢子)，孢子成熟后释放并随气流快速扩散。田间从出现中心病株到整棚(田)发病，一般需要5天，最快2天即可完成整个过程。开展真菌气传研究是遏制病害传播蔓延的关键，对作物绿色、安全、优质生产具有重要指导意义。

分生孢子是真菌的无性孢子，具有抵抗高温、低温、干燥和营养缺乏等不良环境的能力，同时也是真菌病害的重要传播媒介。作为病原物的传播体，孢子质量与其浮力和沉降速度直接相关，决定着传播距离和高度，并明显地随物种变化，是影响病害流行的一个重要因素。

绝大部分真菌的孢子均为微米级，个体极其微小，现有仪器设备不能直接实现单个分生孢子质量的准确称量。至今仍没有称量真菌孢子质量的合适方法。明确孢子质量是开展真菌气传研究工作的基础，更是长久以来病原流行病学研究亟待解决的科学问题，无论是在理论上还是在实践中都具有不可忽视的意义。因此，急切需要寻找一种新的快速、简便称量真菌孢子质量的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种多主棒孢菌分生孢子质量的测定方法，操作简单、步骤简便、适用性强，能够称量真菌分生孢子质量的方法，解决了真菌传播流行研究的迫切需求。本发明方法能够实现绝大部分真菌孢子质量的称量，有助于真菌学家模拟预测病菌传播轨迹，推动真菌流行病学的进一步发展。

本发明采用分析天平称量大量孢子粉的质量，将不可实现的个体研究转化为可操作的群体研究，能有效解决无仪器设备可用的难题；在光学显微镜下利用血球计数板定量观察到的孢子个数，能有效解决真菌孢子个体微小，肉眼无法直接识别统计的问题；另外，仅需对血球计数板0.1mm³计数区的孢子个数进行统计，避免了对全部样品个数进行统计耗时、费力的过程。

本发明通过如下方法实现多主棒孢菌分生孢子质量的测定：收集多主棒孢菌孢子粉并称重、制备多主棒孢菌孢悬液、统计血球计数板计数区内多主棒孢菌分生孢子个数、通过公式计算多主棒孢菌单个分生孢子的质量。

具体地，本发明提供的多主棒孢菌分生孢子质量的测定方法，包括如下步骤：

S1、将供试多主棒孢菌菌株进行活化和扩繁，利用粘附材料粘取多主棒孢菌分生孢子，利用差值法得到多主棒孢菌孢子粉的质量；

S2、配制多主棒孢菌分生孢子悬浮液；