[发明专利]pBD1基因荧光报告肠上皮细胞系的构建方法及其应用

说明书

本发明公开了一种pBD1基因荧光报告肠上皮细胞系的构建方法及其应用。仔猪小肠样品分离得到基因组DNA，并利用PCR技术扩增pBD1启动子片段，序列如SEQ ID NO.1所示，将pBD1启动子片段克隆到pGL4.21荧光报告载体中得到pBD1荧光报告质粒，进行酶切线性化后转染猪肠上皮细胞，从而筛选获得阳性细胞系。本发明提供的筛选细胞系的应用，一次可最多检测数十种营养物质对pBD1基因的调控作用，本发明所公开的方法创新性地利用酶切线性化质粒载体转染细胞，构建了一种可长期稳定表达pBD1基因的筛选细胞系，极大地提高了营养物质的筛选效率，可克服现有方法中细胞因生长状态、不同检测方法等因素造成的干扰，有利于开发具有pBD1基因调控功能的营养物质及其后续应用生产。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种pBD1基因荧光报告肠上皮细胞系的构建方法及其应用。

背景技术

我国是世界养猪大国，养殖规模和猪肉消费位居世界第一，生猪养殖已成为我国畜牧业的支柱产业。然而，长期以来生猪养殖过程中采用的最普遍措施是添加饲用抗生素，因而造成了细菌耐药性、猪肉中抗生素残留以及抗生素排放污染等一系列安全问题。因此，深入开展利用营养手段调控仔猪先天免疫功能及机制的相关研究，从而改善仔猪生长，可以有效满足禁用饲用抗生素的要求，对保障生猪绿色养殖具有重大意义。

抗菌肽是一类广泛存在于动物机体内重要的先天免疫因子，与肠道屏障共同形成了阻止病原微生物入侵的第一道防线。除抗菌作用外，抗菌肽在机体内可能更多地发挥免疫调节功能，如启动和调节获得性免疫，促进淋巴细胞增殖，抑制炎症反应，发挥趋化作用等。其中，防御素类抗菌肽广泛分布于各个组织中，主要在上皮和黏膜组织中表达，具有分子小、性状稳定、活性高、抗菌谱广等优点，是最具代表性的一类内源抗菌肽。pBD1是第一种最早被发现的猪防御素类抗菌肽，对革兰氏阴性菌具有较好的抑制效果，且具有促进细胞因子表达等免疫调节功能。通过外源添加营养物质提高猪肠道的pBD1表达，从而提高猪的机体免疫力、抗应激能力，已成为目前禁抗形式下备受关注的热点，对保障生猪健康养殖具有重要意义。

研究表明，丙酸、正丁酸等短链脂肪酸、支链氨基酸、氧化锌等多种营养物质均可调控猪肠上皮细胞pBD1基因的表达。但现有研究具有较多的局限性，例如实验易受所使用的细胞状态差异、营养物质处理浓度和处理时间差异等多种因素制约，无法较好地指导生产实践；此外，现有研究中评估pBD1基因表达的方法不统一，如部分研究采用qPCR技术测定pBD1基因的相对表达量，另有研究向pBD1基因序列前端插入标签蛋白从而采用WesternBlot技术测定pBD1基因转录并翻译后的蛋白表达量。上述研究中涉及的各种方法差异较大，且对不同营养物质调控pBD1表达的作用缺乏直观的对比，无法同时对多种营养物质的调控功能进行比对，不利于高效筛选营养物质并进行功能开发与实际应用。

发明内容

为了克服现有技术中的问题，本发明旨在提供一种pBD1基因荧光报告肠上皮细胞系的构建方法及其应用。

一种pBD1基因荧光报告肠上皮细胞系的构建方法，

仔猪小肠样品分离得到基因组DNA，并利用PCR技术扩增pBD1启动子片段，序列如SEQ ID NO.1所示，将pBD1启动子片段克隆到pGL4.21荧光报告载体中得到pBD1荧光报告质粒，进行酶切线性化后转染猪肠上皮细胞，从而筛选获得阳性细胞系。

所述的构建方法，采用KpnI-Xhol酶对pBD1荧光报告质粒进行酶切线性化。

所述的构建方法，酶切线性化后的pBD1荧光报告质粒转染猪肠上皮细胞IPEC-J2，pBD1基因荧光报告线性化载体分别与转染试剂、细胞培养基以2.5μg：1μL：1mL的比例混合，处理肠上皮细胞IPEC-J2共24小时，之后利用含3μg/mL嘌呤霉素的培养基筛选7天后存活的阳性细胞。

所述的pBD1基因荧光报告肠上皮细胞系的应用，