[发明专利]一种靶向切除猪CD164基因编码区DNA的成对编辑位点、使用方法及其应用在审
| 申请号： | 202111002995.1 | 申请日： | 2021-08-30 |
| 公开（公告）号： | CN113667674A | 公开（公告）日： | 2021-11-19 |
| 发明（设计）人： | 张立苹;毕延震;华再东;任红艳;朱喆;顾浩;陈矾 | 申请（专利权）人： | 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所 |
| 主分类号： | C12N15/12 | 分类号： | C12N15/12;C12N15/113;C12N15/85;C12N5/10;A01K67/027;C12R1/91 |
| 代理公司： | 武汉科皓知识产权代理事务所(特殊普通合伙) 42222 | 代理人： | 石超群 |
| 地址： | 430064 湖*** | 国省代码： | 湖北;42 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 靶向 切除 cd164 基因 编码 dna 成对 编辑 使用方法 及其 应用 | ||
1.一种靶向切除猪CD164基因编码区DNA的成对编辑位点，其特征在于：所述编辑位点包括T1和T2两个编辑位点，所述T1和T2两个编辑位点位于猪1号染色体CD164基因编码区的2外显子区域；其中T1编辑位点染色体坐标为75441814-75441833，编码区坐标为246-265；T2编辑位点染色体坐标为75442009-75442028，编码区坐标为441-460。
2.根据权利要求1所述的靶向切除猪CD164基因编码区DNA的成对编辑位点，其特征在于：所述T1编辑位点3’端含有AGG，作为Cas9核酸内切酶特异识别的PAM序列，T2编辑位点5’端含有CCT作为Cas9核酸内切酶特异识别的PAM序列。
3.根据权利要求1所述的靶向切除猪CD164基因编码区DNA的成对编辑位点的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)设计编辑靶位点T1和T2的向导序列sgRNA；
(2)构建含有编辑位点T1和T2的sgRNA打靶载体；
(3)培养猪原代成纤维细胞；
(4)转染含有T1和T2编辑位点的打靶载体至猪原代成纤维细胞；
(5)筛选阳性单克隆；
(6)提取阳性单克隆细胞DNA进行PCR鉴定并通过测序验证准确序列。
4.根据权利要求1所述的靶向切除猪CD164基因编码区DNA的成对编辑位点的应用，其特征在于：利用该编辑位点构建CD164基因敲除的猪成纤维细胞系。
5.根据权利要求4所述的靶向切除猪CD164基因编码区DNA的成对编辑位点的应用，其特征在于：利用该编辑位点构建CD164基因敲除的猪成纤维细胞系研究CD164基因在猪抗病育种的作用。
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