[发明专利]一种靶向切除猪CD164基因编码区DNA的成对编辑位点、使用方法及其应用

说明书

本发明涉及生物技术和基因工程的技术领域，具体涉及一种靶向切除猪CD164基因编码区DNA的成对编辑位点、使用方法及其应用，所述编辑位点包括T1和T2两个编辑位点，所述T1和T2两个编辑位点位于猪1号染色体CD164基因编码区的2外显子区域；其中T1编辑位点染色体坐标为75441814‑75441833，编码区坐标为246‑265；T2编辑位点染色体坐标为75442009‑75442028，编码区坐标为441‑460。本发明的两个能基于CRISPR技术有效编辑猪CD164基因的靶位点，可用于Cas9介导的猪CD164基因打靶，为研究CD164基因在猪抗病育种中提供实验材料。

技术领域

本发明涉及生物技术和基因工程的技术领域，具体涉及一种靶向切除猪CD164基因编码区DNA的成对编辑位点、使用方法及其应用。

背景技术

基因转移技术根据外源基因整合的位点特异性可分为两大类，一类是非定点的，即导入的外源基因在靶细胞基因组中整合的位点一般是随机的，包括显微注射、电穿孔、磷酸钙沉淀、逆转录病毒载体感染等：另一类则是定点的，即外源基因导入靶细胞后整合到预先确定的位点或对细胞内靶位点进行定点修饰，这就是依赖于同源重组的基因打靶技术。将外源基因精准敲入猪体细胞的基因组中，一直都是极为困难的，因为早期仅基于同源重组的基因打靶技术效率极低，应用受到很大的限制。直到近年来人工核酸内切酶(engineered endonuclease,EEN)的出现，才彻底改变了这一现状。

CRISPR/Cas技术作为第三代基因组编辑技术在近年迅速发展起来，与基因打靶、ZFN、TALEN等基因修饰技术相比，CRISPR/Cas9具有操作简单、效率高等诸多优势，利用CRISPR/Cas9对重要经济性状基因进行修饰已经成为家畜新品种培育的重要手段。CRISPR/Cas9技术介导的基因突变是指Cas9蛋白通过sgRNA靶向识别并定点切割基因组DNA，导致DNA双链断裂(double strand break,DSB)，细胞通过非同源末端连接修复机制修复DSB时所引发的切割位点处DNA碱基的插入或缺失。目前该技术被成功应用于人类细胞、斑马鱼、小鼠、猴、猪、山羊等的基因组精确修饰；通过对基因的修复机制包括非同源末端连接修复、同源重组修复等，由于CRISPR/Cas突变效率高、制作简单及成本低的特点，被认为是一种具有广阔应用前景的基因组定点改造工具。

唾液酸粘蛋白是一种异质的分泌或膜相关的粘蛋白组，在体内似乎起着两个关键但相反的作用:首先其作为细胞保护剂或抗粘附剂，其次作用为粘附受体。CD164(人类白细胞分化抗原64)，又称内溶双体蛋白，唾液酸核心粘蛋白24，是一种由CD164基因编码的人体蛋白质，其功能为黏附分子，CD164作为I型整合跨膜唾液黏蛋白，作为粘附受体起作用。研究表明CD164在机体造血和调节正常细胞生长分化过程中发挥一定调控作用，并且参与机体免疫应答、细胞附着、异嗜性细胞附着、负调控细胞附着、信号转导、发育、负调控细胞增殖等生理活动。因此，获取CD164基因修饰动物，可为深入研究该基因功能以及相关疾病的治疗提供可靠的动物模型，并为研究该基因在动物抗病育种的作用提供实验材料。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种靶向切除猪CD164基因编码区DNA的成对编辑位点，提供两个能基于CRISPR技术有效编辑猪CD164基因的靶位点，该靶位点可用于Cas9介导的猪CD164基因打靶，并能够将CD164基因功能失活。

本发明的目的之二在于提供一种靶向切除猪CD164基因编码区DNA的成对编辑位点的使用方法，能够成功敲除CD164基因。

本发明的目的之三在于提供一种靶向切除猪CD164基因编码区DNA的成对编辑位点的的应用。

本发明的目的之四在于提供一种靶向切除猪CD164基因编码区DNA的成对编辑位点的应用。