[发明专利]Mstn重组蛋白在斜带石斑鱼筛选中的应用

权利要求书

1.一种mstn重组蛋白在斜带石斑鱼筛选中的应用，其特征在于，包括：

S1斜带石斑鱼Mstn亚细胞定位分析；

S2 Mstn重组蛋白对mstn信号通路下游及相关基因的影响分析；

S3 Mstn重组蛋白对肌肉细胞增殖的影响分析；

其中：S1包括以下步骤：

S101鱼体组织样品采集；

S102将提取后的RNA保存在低温冰箱中备用；

S103按照设计的反转录体系，合成的cDNA于-80℃保存备用；

S104设计目的基因扩增引物，进行反应后，再将目的基因分离、回收、纯化后获得目的基因；

S105对目的片段和载体进行双酶切，然后进行片段回收；

S106通过T4 DNA连接酶连接将载体片段和目的基因片段进行连接，然后进行转化和测序；

S107使用试剂盒对去内毒素质粒进行提取，获得质粒，并且对质粒进行电泳检测；

S108将细胞计数后传入24孔板中，细胞浓度为1×106/mL，置于28℃培养箱中培养18h，待细胞铺满单层的70-80％后即可开始转染，按照每孔800ng质粒，2μL转染试剂的标准进行转染；

S109亚细胞定位；

S2包括以下步骤：

S201培养肌肉原代细胞；

S202用Mstn重组蛋白孵育肌肉原代细胞；

S203肌肉原代细胞RNA提取；

S204 cDNA合成；

S205实时荧光定量PCR；

S3包括以下步骤：

S301培养肌肉原代细胞；

S302用Mstn重组蛋白孵育肌肉原代细胞；

S303用CCK-8法检测细胞增殖状态；

S304用流式细胞仪检测细胞周期。

2.根据权利要求1中所述的mstn重组蛋白在斜带石斑鱼筛选中的应用，其特征在于，S1中，通过构建含mstn的目的质粒，将目的质粒与空载转染到GS细胞中发现，绿色荧光在细胞质中呈点状分布。

3.根据权利要求1中所述的mstn重组蛋白在斜带石斑鱼筛选中的应用，其特征在于，S2中，用Mstn重组蛋白对斜带石斑鱼的肌肉原代细胞进行刺激后，通过实时荧光定量检测仪检测Mstn重组蛋白对mstn信号通路及下游相关基因具有影响。

4.根据权利要求3中所述的mstn重组蛋白在斜带石斑鱼筛选中的应用，其特征在于，mstn信号通路包括p21、smad3、mrf4、myod、myog。

5.根据权利要求1中所述的mstn重组蛋白在斜带石斑鱼筛选中的应用，其特征在于，S303中用浓度为1000nM的Mstn重组蛋白分别刺激肌肉原代细胞5d，通过酶标仪测定肌肉原代细胞每天的OD值来研究Mstn对肌肉细胞增殖的影响。

6.根据权利要求5中所述的mstn重组蛋白在斜带石斑鱼筛选中的应用，其特征在于，在培养的五天内，用Mstn重组蛋白处理的实验组细胞生长明显减缓，对照组和实验组细胞的活性差异在第一天就达到了显著性水平，并且随着处理时间的增加，细胞活性差异进一步扩大。

7.根据权利要求1中所述的mstn重组蛋白在斜带石斑鱼筛选中的应用，其特征在于，S304中通过流式细胞仪检测细胞周期，结果发现用Mstn重组蛋白处理过后的细胞在S期受阻，细胞周期受阻，Mstn重组蛋白抑制斜带石斑鱼肌肉细胞的增殖。