[发明专利]Mstn重组蛋白在斜带石斑鱼筛选中的应用

说明书

本发明涉及一种mstn重组蛋白在斜带石斑鱼筛选中的应用，包括以下步骤：S1斜带石斑鱼Mstn亚细胞定位分析；Mstn重组蛋白对mstn信号通路下游及相关基因的影响分析；Mstn重组蛋白对肌肉细胞增殖的影响分析。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种Mstn重组蛋白在斜带石斑鱼筛选中的应用。

背景技术

肌肉生长抑制素基因(myostatins,mstn)是一种抑制肌肉细胞增殖生长的负调控基因，属于TGF-β家族成员，故又称为gdf-8。研究表明，该基因表达的抑制或突变失活，能阻断Mstn对肌细胞增殖生长的抑制作用，引起广泛的肌肉增殖并显著降低体表脂肪的沉积，产生以肌纤维数量显著增加、体重显著增大为特征的肌肥大现象，即所谓的“双肌性状”。

制备mstn基因工程疫苗并用该疫苗进行免疫，然后利用自身的免疫系统长期生产抗Mstn的抗体，该抗体完全具有专门结合和抑制Mstn的能力，从而能够解除Mstn对肌细胞生长的抑制作用。目前，关于利用mstn进行主动免疫的方法主要集中在畜牧业，如牛、羊、猪等，在水产领域中，尤其是斜带石斑鱼的养殖中很少有关于mstn的报道。

发明内容

本发明克服了现有技术的不足，提供Mstn重组蛋白在斜带石斑鱼筛选中的应用。

为达到上述目的，本发明采用的一种技术方案为：

一种mstn重组蛋白在斜带石斑鱼筛选中的应用，包括：

S1 斜带石斑鱼Mstn亚细胞定位分析；

S2 Mstn重组蛋白对mstn信号通路下游及相关基因的影响分析；

S3 Mstn重组蛋白对肌肉细胞增殖的影响分析

其中：S1包括以下步骤：

S101 鱼体组织样品采集；

S102 将提取后的RNA保存在低温冰箱中备用；

S103 按照设计的反转录体系，合成的cDNA于-80℃保存备用；

S104 设计目的基因扩增引物，进行反应后，再将目的基因分离、回收、纯化后获得目的基因；

S105 对目的片段和载体进行双酶切，然后进行片段回收；

S106 通过T4 DNA连接酶连接将载体片段和目的基因片段进行连接，然后进行转化和测序；

S107 使用试剂盒对去内毒素质粒进行提取，获得质粒，并且对质粒进行电泳检测；

S108 将细胞计数后传入24孔板中，细胞浓度为1×106/mL，置于28℃培养箱中培养18h，待细胞铺满单层的70-80％后即可开始转染，按照每孔800ng质粒，2μL转染试剂的标准进行转染；

S109 亚细胞定位；

S2 包括以下步骤：

S201 培养肌肉原代细胞；

S202 用Mstn重组蛋白孵育肌肉原代细胞；

S203 肌肉原代细胞RNA提取；

S204 cDNA合成；

S205 实时荧光定量PCR；

S3 包括以下步骤：

S301 培养肌肉原代细胞；

S302 用Mstn重组蛋白孵育肌肉原代细胞；

S303 用CCK-8法检测细胞增殖状态；