[发明专利]一种大鼠心肌细胞和心肌成纤维细胞分离和培养的方法

权利要求书

1.一种大鼠心肌细胞和心肌成纤维细胞分离和培养的方法，它包括：

1）将新生乳鼠心脏剪下，置于冰上预冷的CBFHH缓冲液中，洗涤心脏组织去除血水，使用眼科直剪剪去心房组织，放入提前加有预冷CBFHH缓冲液的6孔板中依次洗涤并逐步剪碎心脏组织，最后剪为0.5-1 mm³大小的组织块；

2） 使用 II型胶原酶与胰酶-EDTA消化酶混合液进行初次消化，然后加入混有DNase I的II型胶原酶溶液进行短时、多次消化；

3） 离心收集细胞沉淀，心肌成纤维细胞培养液I重悬细胞后，将细胞悬液接种10.0 cm平皿，贴壁30 min，收集培养心肌成纤维细胞；

4）收集含心肌细胞的细胞悬液至新10.0 cm平皿，继续贴壁45 min后，收集含较高纯度心肌细胞的细胞悬液，离心后，使用含Brdu的心肌细胞培养液II重悬细胞沉淀，以每孔5-10×10⁵个细胞/mL的密度，加入提前包被多聚赖氨酸的细胞6孔板中，贴壁培养心肌细胞；

5）培养40 h后更换为含1%FBS的心肌细胞培养液III，长期培养心肌细胞；

步骤1）所述CBFHH缓冲液为含137 mM NaCl，5.36 mM KCl，0.81 mM MgSO₄﹒7H₂O，5.55mM D-葡萄糖，0.44 mM KH₂PO₄﹒7H₂O，0.34 mM NaH₂PO₄﹒2H₂O及终浓度20 mM HEPES，pH值为7.5的缓冲液；

步骤2）所使用的II型胶原酶与胰酶-EDTA消化酶混合液组成为0.25mg/mL的II型胶原酶及0.05%的胰酶-EDTA；所述的混有DNase I的II型胶原酶溶液组成 为0.001% DNase I的0.8 mg/mL的II型胶原酶溶液；

步骤3）所述的细胞培养液I组成为1%双抗，1% GlutaMAX，1%NEAA，1%丙酮酸钠，0.1% 2-Mercaptoethanol，10% FBS，86% DMEM/F12；

步骤4）所述细胞培养液II组成为1%双抗，1%ITS，100 μM Brdu，100 μM CaCl₂，2g/LBSA，5%马血清和93%DMEM/F12；

步骤5）所述细胞培养液III组成为1%双抗，1%ITS，1%FBS，19.4%M199和77.6%DMEM/F12。

2.根据权利要求1所述的一种大鼠心肌细胞和心肌成纤维细胞分离和培养的方法，其特征在于：所述的多聚赖氨酸为0.01%的多聚赖氨酸溶液。