[发明专利]一种大鼠心肌细胞和心肌成纤维细胞分离和培养的方法

说明书

本发明公开了一种大鼠心肌细胞和心肌成纤维细胞分离和培养的方法，它包括：(1)分离新生1‑2天的乳鼠心脏；(2)消化乳鼠心脏组织；(3)使用心肌成纤维细胞培养液I重悬细胞沉淀，差速贴壁培养；(4)移走混有心肌细胞的悬液，培养心肌成纤维细胞；将混有心肌细胞的悬液过筛，离心，使用心肌细胞培养液II重悬心肌细胞，培养；(5)心肌细胞贴壁培养40h后，更换为含1%FBS的心肌细胞培养液III，心肌细胞可保持搏动并继续存活33天以上。本发明可同时获得两种细胞，分离操作耗时短，心肌细胞搏动时间早、存活时间长、在较长的培养时间内维持高的细胞纯度，心肌成纤维细胞、纯度高、得率高。

技术领域

本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种大鼠心肌细胞和心肌成纤维细胞分离和培养的方法。

背景技术

心肌细胞体外培养能提供单一细胞的同源性集落，并且不受神经、体液因素影响，已成为研究心肌信号传导和药物筛选的基本方法之一。体外培养的心肌细胞中通常存在两大类：心肌细胞(myocardial cells)和心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts，CF)，还有少量的血管内皮细胞等。此外因其特殊的组织结构，心肌细胞在分离时极易受伤，心肌成纤维细胞在培养数代后也出现老化。因此，如何快速分离得到纯化的心肌细胞和心肌成纤维细胞是实验成功的关键。

心肌细胞的培养方法已有很多报道，但均存在细胞存活率低、纯度不高等问题。常见的心肌细胞分离方式有2种，组织块分离法和酶消化法，其中组织块分离法目前很少应用，多采用酶消化法。常用的消化酶有胰蛋白酶、胶原酶以及Dispase和透明质酸酶。胰蛋白酶作用较强，可分解心肌组织间酪蛋白成分，有效解离心肌细胞，但对心肌细胞膜蛋白亦有较强的破坏作用，容易损伤心肌细胞。而胶原酶作用较缓和，能消化细胞间质中的胶原纤维以释放细胞，对细胞损伤较小，目前被广泛采用。

原代分离培养动物的心肌细胞与心肌成纤维细胞，以此为基础，建立各种药物刺激或诱导的、与心脏疾病相关的体外研究模型，是探索和解决心脏相关各种疾病的有效的技术手段。

由于源自心肌组织的原代培养为混合细胞培养，如何分离相对纯净的心肌细胞，在实验周期中抑制非心肌细胞生长，是保证实验成功的关键步骤。本发明集中优化了新生SD大鼠原代心肌细胞的分离与培养技术方法，同时保证原代心肌成纤维细胞的扩增与培养，是一种非常高效、便捷的原代细胞分离与培养的技术方法。

发明内容

本发明的目的是为了解决目前新生大鼠心肌细胞培养方法存在分离过程耗时长、心肌细胞长期培养难以维持高纯度，进而影响后续实验等问题，而提供的一种大鼠心肌细胞和心肌成纤维细胞分离和培养的方法。

一种大鼠心肌细胞和心肌成纤维细胞分离和培养的方法，它包括：

1、 新生乳鼠，将心脏剪下后置于冰上预冷的CBFHH缓冲液中，洗涤心脏组织去除血水，使用眼科直剪剪去心房组织，放入提前加有预冷CBFHH缓冲液的6孔板中依次洗涤并逐步剪碎心脏组织，最后剪为0.5-1 mm³大小的组织块；

2、 使用 II型胶原酶与胰酶-EDTA消化酶混合液进行初次消化，然后加入混有DNase I的II型胶原酶溶液进行短时、多次消化；

3、 离心收集细胞沉淀，心肌成纤维细胞培养液I重悬细胞后，将细胞悬液接种10.0 cm平皿，贴壁30 min，收集培养心肌成纤维细胞；

4、 收集含心肌细胞的细胞悬液至新10.0 cm平皿，继续贴壁45 min后，收集含较高纯度心肌细胞的细胞悬液，离心后，使用含Brdu的心肌细胞培养液II重悬细胞沉淀，以每孔5-10×10⁵个细胞/mL的密度，加入提前包被多聚赖氨酸的细胞6孔板中，贴壁培养心肌细胞；

5、 培养40 h后更换为含1%FBS的心肌细胞培养液III，长期培养心肌细胞；