[发明专利]岭南药用植物穿心莲原生质体的制备及应用

权利要求书

1.一种原生质体酶解液，其特征在于，包括1.5wt.％纤维素酶R-10、0.75wt.％离析酶R-10、0.6M甘露醇、20mM MES、20mM KCl、10mM CaCl₂和0.1wt.％BSA。

2.权利要求1所述酶解液的制备方法，包括如下步骤：

将所述纤维素酶R-10、离析酶R-10、甘露醇、MES和KCl混合，在55℃的条件下温育10min，冷却至室温，得第一混合液；

将所述第一混合液与CaCl₂和BSA混合，过滤除菌得酶解液。

3.一种穿心莲原生质体的制备方法，包括以下步骤：

切碎穿心莲幼苗的下胚轴和叶组织后调节渗透压，得穿心莲幼苗下胚轴和叶的碎片；

将所述碎片与权利要求1所述酶解液混合酶解3～4小时，得穿心莲酶解液；

将所述穿心莲酶解液与W5溶液混合，过滤得原生质体。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述培养的光暗时间比为12h：12h；所述培养的光照强度为100μmolm^-2s^-1。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述培养的时间为20～40d；所述培养的温度为20～30℃。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述渗透压调节包括将切碎植物幼苗的下胚轴和叶组织置于渗透压调节液中黑暗培养30min，所述渗透压调节液包括0.6M甘露醇溶液。

7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述W5溶液包括5mM KCl，154mM NaCl，125mM CaCl₂和2mM MES。

8.一种穿心莲原生质体瞬时转染的方法，包括如下步骤：

将利用权利要求3～7任一项所述方法制备得到的穿心莲原生质体与外源性质粒和PEG溶液混合，黑暗反应12～15min，得反应液；

混合W5溶液与所述反应液，分离得转染的原生质体。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述外源性质粒、穿心莲原生质体和PEG溶液的体积比为1：10：11。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述外源性质粒含有标记基因。