[发明专利]岭南药用植物穿心莲原生质体的制备及应用

说明书

本发明属于原生质体制备技术领域，具体涉及岭南药用植物穿心莲原生质体的制备及应用。本发明提供了一种原生质体酶解液，可以更好地将细胞壁去除，使细胞游离出来，同时细胞维持很好的生理状态，并且利用原生质体进行转染时，调整甘露醇浓度，维持细胞渗透压，减少了原生质体在转染过程中的皱缩或涨破，保证了原生质体的细胞形态。利用本发明所述酶解液能够缩短原生质体制备时的酶解时间，保证了原生质体的高活性和高产量，可用于基因瞬时表达研究。

技术领域

本发明属于原生质体制备技术领域，具体涉及岭南药用植物穿心莲原生质体的制备及应用。

背景技术

植物原生质体是指细胞壁以内各种结构的总称，具有再生形成完整植株的能力。目前制备植物原生质体的主要手段是酶解法，然而利用酶解法制备植物原生质体时，如黄瑞华等利用酶解6小时的方法制备穿心莲原生质体(黄瑞华等.穿心莲叶片原生质体制备方法的建立与优化[J/OL].分子植物育种:1-16.http://kns.cnki.net/kcms/detail/46.1068.S.20210428.1414.012.html.)，酶解时间长，制备效率不高。如何缩短制备植物原生质体的时间，是原生质体制备行业亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种原生质体酶解液，能够缩短制备原生质体时酶解时间，提高原生质体的制备效率。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供了一种原生质体酶解液，包括1.5wt.％纤维素酶R-10、0.75wt.％离析酶R-10、0.6M甘露醇、20mM MES、20mM KCl、10mM CaCl₂和0.1wt.％BSA。

本发明提供了上述酶解液的制备方法，包括如下步骤：

将所述纤维素酶R-10、离析酶R-10、甘露醇、MES和KCl混合，在55℃的条件下温育10min，冷却至室温，得第一混合液；

将所述第一混合液与CaCl₂和BSA混合，过滤除菌得酶解液。

本发明提供了一种穿心莲原生质体的制备方法，包括以下步骤：

切碎穿心莲幼苗的下胚轴和叶组织后调节渗透压，得穿心莲幼苗下胚轴和叶的碎片；

将所述碎片与上述酶解液混合酶解3～4小时，得穿心莲酶解液；

将所述穿心莲酶解液与W5溶液混合，过滤得原生质体。

优选的，所述培养的光暗时间比为12h：12h；所述培养的光照强度为100μmol m^-2s^-1。

优选的，所述培养的时间为20～40d；所述培养的温度为20～30℃。

优选的，所述渗透压调节包括将切碎植物幼苗的下胚轴和叶组织置于渗透压调节液中黑暗培养30min，所述渗透压调节液包括0.6M甘露醇溶液。

优选的，所述W5溶液包括5mM KCl，154mM NaCl，125mM CaCl₂和2mM MES。

本发明提供了一种穿心莲原生质体瞬时转染的方法，包括如下步骤：

将上述穿心莲原生质体与外源性质粒和PEG溶液混合，黑暗反应12～15min，得反应液；

混合W5溶液与所述反应液，分离得转染的原生质体。

优选的，所述外源性质粒、穿心莲原生质体和PEG溶液的体积比为1：10：11。

优选的，所述外源性质粒含有标记基因。