[发明专利]一种利用转基因大豆生产α-淀粉酶的方法及表达载体

说明书

本发明公开了一种利用转基因大豆生产α‑淀粉酶的方法及表达载体，所述方法是将含α‑淀粉酶表达框的表达载体导入到大豆基因组中，获得能够生产α‑淀粉酶的转基因大豆；所述α‑淀粉酶表达框包括启动子、α‑淀粉酶编码基因、终止子。本发明转基因大豆在种子中实现淀粉酶的高表达，所生产的淀粉酶的活性极高，最高每克种子10000酶活单位以上；本发明的转基因大豆生产的淀粉酶在作为饲料添加剂、食品加工添加剂等很多领域的应用时无需经过分离浓缩，可以直接应用，降低了生产成本；本发明利用大豆种子生物反应器生产淀粉酶比传统微生物发酵方法节省能源，是一种更加环境友好型的生产方式。

(一)技术领域

本发明涉及一种利用转基因大豆生产α-淀粉酶的方法及表达载体。

(二)背景技术

世界上对酶的需求逐步增加，从2003年到2008年，世界上的酶需求基本上以2倍的速度在增长。从2009年酶市场约51亿美元，到2018年全球酶市场规模达到93亿美元，预计2019-2025年，酶市场将以年复合增长率7.1％的速度增长，达到149亿美元的规模。而这其中淀粉酶在全球酶市场中约占30％，被广泛地应用于工业领域。

淀粉酶根据酶水解产物异构类型的不同可分为α-淀粉酶和β-淀粉酶。α-淀粉酶(α-1,4-glucan-4-glucanohydrolase,EC 3.2.1.1)是外切酶，主要分布在动物、植物、微生物中，它以随机作用方式切断淀粉、糖原、寡聚或多聚糖分子内的α-1,4-糖苷键，将淀粉水解为糊精和一系列以葡萄糖为组成单位的低聚糖。食品工业中α-淀粉酶主要应用于制造果糖和果葡糖浆、提高烘培发酵速率和烘培食品的保质期和柔软度等。在洗涤剂业中，α-淀粉酶可以将含淀粉的食物颗粒消化成较小的水溶性寡糖，用水冲洗后达到去除污渍的目的。在造纸业和纺织业中应用于产品的上浆、脱浆。在燃料乙醇的生产，α-淀粉酶通过将淀粉液化水解后经过糖化，在复合糖化酶的作用下产生葡萄糖，而葡萄糖又作为酿酒酵母的底物，经过发酵后产生酒精。α-淀粉酶也作为饲料添加剂，以提高饲料的利用率。

目前淀粉酶的工业生产一般采用微生物发酵法，但这种生产方法工艺比较复杂、生产设备要求较高，提纯过程费时费力，运输储存过程中对温度要求严格。随着分子农业的发展，农作物作为一种绿色生物反应器在生产外源蛋白方面已获得了大量使用。从20世纪80年代早期第一株转基因植物诞生以来，利用植物生物反应器表达蛋白质就应运而生。1997年，Hood等(Hood EE,Withcher DR,Maddock S,et al.Commercial production ofavidin from transgenic maize：characterization of transformant,production,processing,extaction and purification[J].Molecular Breeding,1997,39(4):291-306)报道了在植物中表达巧白素，并将其提取纯化上市销售。接下来的十几年中研究者们陆续在各种植物中表达了各种外源蛋白，例如在烟草中表达了乙肝病毒表面抗原和疟原虫表面抗原决定簇；在马铃薯中表达了热不稳定肠毒素，其功能与大肠杆菌表达的热不稳定肠毒素功能相同(Obembe OO,Popola JO,Leelavathi S,et al.Advances in plantmolecular farming[J].Biotechnology Advance,2011,29(2):210-222)。尽管转基因动物、细菌和真菌都可以用来生产蛋白，但在植物上往往可以获得更高的经济价值。利用高等植物生产外源蛋白具有以下几点优势：1)与转基因动物饲养、转基因微生物发酵相比显著地降低了生产成本；2)植物具有现成的耕种、收割以及加工的基础设施和专门技术；3)植物不含有已知的可能污染终产物的人类病原体；4)高等植物能合成正确的折叠、糖基化并具有活性的来自真核生物的蛋白；5)蛋白表达在植物细胞中避免了降解，增加了稳定性。有研究表明于休眠期的种子含水量一般比较低，此时种子中的蛋白水解酶活性很低，因此外源蛋白可以长时间地在种子中贮存且保持活性。如将重组疫苗抗原CTB于水稻种子中进行表达，放置在常温条件下2年以上，经检测该重组抗原仍保持较高的活性(Boothe J,NykifoukC,Shen Y,et al.Seed-based expression systems for plant molecular farming[J].Plant Biotechnology Journal,2010,8(5):588-606)。因此种子生物反应器不仅为重组蛋白的保存提供了理想载体，还为后续的分离和纯化提供了便利条件。