[发明专利]基于颜色编码与可编程性荧光探针的多重靶标原位检测方法

说明书

本发明公开了基于颜色编码与可编程性荧光探针的高通量多重靶标原位检测方法，所述方法通过不同荧光标记核酸探针对待测靶标进行多轮次重复成像检测，并根据靶标在不同轮次成像中荧光信号颜色种类及变化顺序来区分识别多种靶标。该方法解决了荧光检测设备检测通道有限，可同时分析靶标数少的问题，因此本发明的方法突破了荧光显微镜检测多重数少的限制。此外，这种方法还弥补了现有“基于多轮成像分析技术”的多重检测方法存在多靶标分析耗时长的缺陷，例如利用具有四个荧光检测通道的显微镜检测64种靶标，现有“基于多轮成像分析技术”的方法至少需要检测16轮次，而本方法最少只需要3轮次有序颜色编码成像分析即可完成，实现了高通量多靶标分析。

技术领域

本发明属于定位与多重检测领域，具体涉及基于颜色编码与可编程性荧光探针的多重靶标原位检测方法。

背景技术

全面分析复杂生物系统中细胞内蛋白质的能力对于增进生物学家对正常生理学和疾病发病机理的理解至关重要。“人类细胞图谱计划(Human Cell Atlas Project)”的启动，让单细胞蛋白质研究进入了快速前进轨道。

基于荧光显微镜的成像技术可在特定靶标的原位环境中对其进行检测分析(其中通过成像鉴别、原位定位和定量靶标)，保存了靶标原始的空间信息。但是，可用于荧光成像的荧光基团的激发光或发射光光谱之间存在重叠区域，使可同时用于不同靶标区分的荧光基团个数有限。因此，荧光基团光谱重叠问题限制了荧光显微镜检术同时可检测的靶标种类数，通常可同时检测靶标数不超过五个，也因此，使单细胞蛋白质成像方法受到了有限多重能力的困扰。

为解决这一问题，改进原位靶标多重检测技术，研究者们提出了各种多重成像的方法。而真正在研究实践中实现蛋白质等靶标原位多重检测技术的，则以基于甲酰胺缓冲液“脱色”策略的方法为代表。对于同一个待测样本，该方法一次利用一种荧光成像探针对其中一种靶标进行检测，然后通过甲酰胺缓冲液对该靶标的荧光信号进行脱色处理，然后再利用另一种荧光成像探针对其中另一个靶标进行检测，如此循环往复，理论上不依赖荧光显微镜的检测通道数，可以实现靶标原位多重检测。然而，其中有一点不可忽略的是，这类多重分析技术为了实现蛋白质原位检测的高度多重性，需要依赖多轮成像，靶标越多成像轮次就越多，成像轮次呈现线性增长，消耗大量时间。该技术还涉及到多次洗涤过程等步骤，靶标越多，成像轮次越多，洗涤步骤也越多。多步洗涤对低丰度靶标损失的潜在影响是不可忽略的。这些冗杂步骤积累耗费的时间以及多步洗涤问题，对于快速病理诊断领域来说仍然是不能规避的问题。因此需要改进待测样本中多靶标的原位多重检测技术，以达到检测通量高、步骤少、并且突破荧光显微镜检测通道数限制的目的。

发明内容

发明目的：为了突破荧光显微镜检测通道数的限制(如目前商用荧光显微镜多为小于5个荧光检测通道)，改进原位靶标多重检测技术，提高原位检测通量，本发明提供了一种基于颜色编码与可编程性荧光探针策略进行多重靶标原位检测方法，例如细胞内的蛋白质、多肽或其他所需靶标的检测方法。

技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了基于颜色编码与可编程性荧光探针的多重靶标原位检测方法，所述检测方法通过不同荧光标记核酸探针对多种待测靶标进行多轮次重复成像检测，并根据靶标在不同轮次成像中荧光信号颜色种类及变化顺序来区分识别各个靶标种类，具体包括如下步骤：将样本中的每种待测靶标通过直接或间接方式结合一种或多种序列不同的寡核苷酸片段，每种寡核苷酸片段与一种或多种序列互补的荧光标记核酸探针通过碱基互补原理进行杂交后，用荧光成像设备成像，使待测靶标呈现对应的荧光信号，成像结束后，使用外加作用力或缓冲液去除所有荧光标记核酸探针，然后再次加入荧光标记核酸探针进行杂交成像，如此进行多轮的荧光标记核酸探针杂交成像，多轮杂交成像结束后，通过荧光信号出现的种类、顺序和位置来对样本中的不同靶标进行定性和定位检测。

在一个方面，本发明的一般性涉及包含同一个靶标的重复检测策略，该策略通过使用荧光成像探针杂交与去杂交的循环过程实现相同靶标的相同和/或不同荧光的有序反复检测。