[发明专利]一种蒙古鲌精子冷冻保存技术

权利要求书

1.一种蒙古鲌精子冷冻保存技术，其特征在于，包括稀释液配制、抗冻液配制、精子采集、鲜精活力检测、精子分装、降温程序、升温解冻程序、冻精活力检测。

2.根据权利要求1所述的一种蒙古鲌精子冷冻保存技术，其特征在于，具体包括如下步骤：

(1)稀释液D-15配制：用分析天平称取1.6g NaCl、0.1g KCl、3.0g葡萄糖，溶于150mL水中；转移到200mL容量瓶中，定容到200mL；倒入250mL抽滤瓶中，过滤；放于4℃保存；

(2)抗冻液配制：用量筒量取36mL D-15稀释液，倒入50mL离心管中；用5mL移液枪吸取4mL乙二醇，加入上述离心管中；用分析天平称取0.2g海藻糖，加入上述离心管中；用涡旋震荡仪充分混匀；

(3)鲜精活力检测：用10微升移液枪吸取10微升精液至200微升离心管中，加入50微升D-15稀释液，吹打混匀；吸取1微升混合液至载玻片，调节显微镜至合适焦距；加入10微升50％D-15稀释液激活精子，显微镜下观察精子运动情况，使用精子活力检测系统(CASA)检测精子的活力；

(4)精子分装：用5mL移液枪将精液转移到50mL离心管中，同时测量其体积；按照1:5加入抗冻液，吹打混匀；量取240微升精液抗冻液混合液至2mL冻存管中，全部分装完毕后放于冰上暂时保存；

(5)降温程序：将装有精液的2mL冻存管横放于高度为4cm的泡沫板上，使其漂浮在液氮面上；静置3min后，迅速转移到液氮中保存。

3.根据权利要求2所述的一种蒙古鲌精子冷冻保存技术，其特征在于，所述步骤(3)前面增加精子采集步骤：在蒙古鲌繁育季节，撒网捞出性成熟的蒙古鲌雄鱼，用干毛巾擦干泄殖孔周围，轻压腹部，将精液挤到培养皿中，迅速转移到冰上。

4.根据权利要求2所述的一种蒙古鲌精子冷冻保存技术，其特征在于，所述步骤(4)前面增加升温解冻程序：从液氮中取出装有精液的2mL冻存管；迅速插入40℃水浴锅中；不断摇晃直至精液完全解冻。

5.根据权利要求2所述的一种蒙古鲌精子冷冻保存技术，其特征在于，在所述步骤(5)之前，吸取1微升解冻后的精液于载玻片上，调节显微镜至合适焦距；加入10微升50％D-15稀释液激活精子，显微镜下观察精子运动情况，使用精子活力检测系统(CASA)检测精子的活力。