[发明专利]一种蒙古鲌精子冷冻保存技术

说明书

本发明公开了一种一种蒙古鲌精子冷冻保存技术，其特征在于，包括稀释液配制、抗冻液配制、精子采集、鲜精活力检测、精子分装、降温程序、升温解冻程序、冻精活力检测。本发明采用乙二醇与海藻糖的复合配方，实现了更好的保存效果，冷冻保存蒙古鲌精子一个月后复苏，激活率达到70％以上。本发明采用的冷冻容器为0.25mL麦管，实际每支麦管装有的精子量仅为0.03mL左右。采用少量多管方式，在后期复苏验证、解冻激活都可以灵活选择复苏/解冻管数。解冻过程快速、操作简单，容易复苏大量精子。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及生物材料/组织冷冻保存领域，尤其是精子冷冻保存技术。

背景技术

生物配子的冷冻保存技术在上世纪50年代首次取得成功以来，经过几十年的发展，目前在人类医疗领域、动植物优良遗传育种的保存以及野生濒危物种的种质保存等方面都发挥着重要的作用。其中，对于鱼类精子冷冻保存的研究相对较少，但也有一些鱼类的精子实现了冷冻保存，例如大泷六线鱼(专利号CN202110469108.5)、泉水鱼(专利号CN202110227761.0)、棕点石斑鱼(专利号CN201710039157.9)等，而我国大多数的经济鱼类都还未能实现精子冷冻保存。蒙古鲌属鲤形目，鲤科，鲌亚科，鲌属，在我国广泛分布于分布在黑龙江、黄河、淮河、长江、钱塘江、海南岛、珠江等水系，是重要的经济鱼类。

与本发明最相似的现有技术是程顺等人发表的《翘嘴鲌精子生理特性及超低温冷冻的研究》一文中的冷冻方案。该方案主要步骤为：(1)稀释液D-15配制：称取0.80g NaCl，0.05g KCl，1.50g葡萄糖，溶于100mL纯水中；(2)抗冻液配制：用D-15稀释液配制10％乙二醇溶液，放于4℃冰箱备用；(3)精子采集：提前10h对雄鱼注射绒毛膜促性腺激素(HCG)和促黄体释放激素(LRH-A₂)，采集精子时用干毛巾擦干鱼腹部，轻按鱼腹使精液流入离心管中；(4)加入抗冻液分装：将精液和抗冻液按1:5比例混匀，与4℃下平衡5-10min后分装入0.25mL麦管中(每支装约0.2mL)；(5)冷冻保存：将分装好的麦管放于液氮上方3-4cm处3-5min后，迅速转入液氮中保存。

程顺等人的方案得到的冷冻精子的激活率为60％左右，与新鲜精子相比仍有一定差距，可以进一步优化改善。该方案中的抗冻剂采用的是乙二醇作为单一抗冻剂，单一抗冻剂在冷冻保存中的缺点在于难以兼顾保护效果与细胞毒性，即为了起到更好的保护效果往往需要更高浓度的抗冻剂，而高浓度的抗冻剂对精子会有毒害作用。因此现在越来越多的方案开始采用复合抗冻剂，在降低了每一种抗冻剂的浓度的同时，保证整体的保护效果，实现更好的冷冻保存。

本方案采用的冷冻容器为0.25mL麦管，实际装管量为0.2mL，考虑到其精液与抗冻液按照1:5混合，因此实际每支麦管装有的精子量仅为0.03mL左右，在实际繁育过程中需要解冻大量管数的精子，才能达到人工授精所需精子量，不便于操作。

目前没有专门针对蒙古鲌精子的冷冻保存方案，最接近的方案为冷冻翘嘴鲌精子的方法，因此为了实现蒙古鲌精子的冷冻保存，有必要开发新的保存方案。

发明内容

本申请提供了一种蒙古鲌精子冷冻保存技术，其目的在于，第一：探寻合适的复合抗冻剂配方，提高冻存后蒙古鲌精子的激活率。第二：使用冻存管进行蒙古鲌精子冷冻保存，提高保存量，便于人工授精实验操作。第三：探索出一套能够有效冷冻保存蒙古鲌精子的方法，填补蒙古鲌精子冷冻保存领域的空白。

本申请是通过以下技术方案实现的：

一种蒙古鲌精子冷冻保存技术，包括稀释液配制、抗冻液配制、精子采集、鲜精活力检测、精子分装、降温程序、升温解冻程序、冻精活力检测五个步骤，具体如下：

(1)稀释液D-15配制：用分析天平称取1.6g NaCl、0.1g KCl、3.0g葡萄糖，溶于150mL水中；转移到200mL容量瓶中，定容到200mL；倒入250mL抽滤瓶中，过滤；放于4℃保存；