[发明专利]5-氨基乙酰丙酸生产菌及其构建方法

说明书

本发明公开了一种5‑氨基乙酰丙酸生产菌及其构建方法，包括以下步骤：(1)将枯草芽孢杆菌中的pxpR、PoxB、ptsG、sucC、sucD和pta基因敲除，获得枯草芽孢杆菌工程菌；(2)将质粒pHT43‑J用AatⅡ和SmaⅠ双酶切处理，将hemO基因整合到双酶切处理后的质粒pHT43‑J上，得到重组质粒pHT43‑J‑hemO，再用XbaⅠ和BamHⅠ对重组质粒pHT43‑J‑hemO进行酶切处理，将rhtA基因整合到酶切处理后的重组质粒pHT43‑J‑hemO上，获得第一重组表达载体；将质粒pHT01用BamHⅠ和XbaⅠ双酶切，再将hemF基因整合到双酶切处理后的质粒pHT01上，获得第二重组表达载体；(3)将获得的第一重组表达载体和第二重组表达载体导入到枯草芽孢杆菌工程菌中，构建得到5‑氨基乙酰丙酸生产菌。本发明的生产菌提高了5‑氨基乙酰丙酸的产量。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种5-氨基乙酰丙酸生产菌及其构建方法。

背景技术

5-氨基乙酰丙酸(5-Aminolevulinic acid，简称ALA)，是合成吡咯类化合物(血红素、叶绿素、血红素及维生素B₁₂等)的重要中间体，在动植物细胞和微生物细胞中均可合成。ALA因其易分解、在环境中无残留而作为绿色的农用化学品广泛应用于除草剂、杀虫剂以及植物生长调节剂等，在农业领域内有着广泛的用处。近年来，因其在光驱动疗法治疗癌症上的特殊重要作用而重新引起人们的广泛的重视，在癌症治疗领域，ALA也有其独有的优点：治疗效果好、毒副作用小、治疗确切稳定。因此在皮肤癌、膀胱癌、直肠癌等各类癌症的临床治疗中也有广泛的应用。

ALA的合成方法主要有化学合成法和微生物发酵法两种，其中化学合成法因其步骤繁复、造成的污染严重，产物收率较低等缺点日益被微生物发酵法所取代。微生物发酵法是通过诱变菌株或重组工程菌株，经过优化发酵条件等方法让微生物经C4或者C5途径其大量积累ALA的方法。

随着生物技术的高速发展，基因工程菌的构建成为了高效生产活性蛋白质产物的重要方法。目前利用大肠杆菌表达系统合成ALA的研究较多，Mariet和Zeikus获得Escherichia coli重组菌株，ALA发酵产量达到了3.79g/L。L.Xie et al.等利用含有R.sphaeroides的ALA合成酶基因的重组大肠杆菌，经发酵优化，ALA产量达到5.2g/L。浙江大学林建平课题组通过优化hemA基因的表达和发酵条件，ALA最高产量达到了7.3g/L。但是大肠杆菌中的表达不存在信号肽，产品多为胞内产物，提取困难，且内毒素很难除去。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是革兰氏阳性菌，细胞壁不含内毒素，能形成芽孢，是一些重要工业酶制剂的生产菌。刘锦妮构建了hemA和hemL基因的表达载体，将两个表达载体分别电转化至B.subtilis 1A747感受态细胞中，获得重组菌，用麦芽糖进行诱导表达，结果表明得到较大量的谷氨酰t-RNA还原酶蛋白和谷氨酰t-RNA合成酶蛋白，并促进了枯草芽孢杆菌中5-氨基乙酰丙酸的合成，重组菌的发酵上清液中5-氨基乙酰丙酸的含量最高为46.75mg/L(西北农林科技大学硕士学位论文，2008年)。

但与现有大肠杆菌表达系统相比，利用枯草芽孢杆菌生产5-氨基乙酰丙酸的产量仍有待进一步提高。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种5-氨基乙酰丙酸生产菌及其构建方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种5-氨基乙酰丙酸生产菌的构建方法，包括以下步骤：

(1)采用Red同源重组技术将枯草芽孢杆菌中的pxpR、PoxB、ptsG、sucC、sucD和pta基因敲除，获得枯草芽孢杆菌工程菌；