[发明专利]p53及UTX信使RNA纳米粒的制备方法及该信使RNA的应用

权利要求书

1.p53-mRNA及UTX-mRNA纳米粒的制备方法，其特征在于该制备方法包括以下步骤：

1）体外合成化学修饰p53-mRNA及UTX-mRNA

携带T7启动子的人p53及UTX基因开放阅读框质粒形成线性化DNA，再采用PCR扩增包含T7启动子的p53及UTX开放阅读框，并对PCR产物进行纯化，得到纯化的聚合酶链式反应产物；

将MEGAscript®T7转录试剂盒与纯化的聚合酶链式反应产物、3′-O-Me-m7G(5′)ppp(5′)G帽结构类似物、三磷酸鸟苷、5-甲基-胞苷三磷酸、三磷酸腺苷和假尿苷-5’-三磷酸反应，反应完成后进行脱氧核糖核酸酶处理,再使用 poly(A)试剂盒将3’poly(A)试剂盒添加到IVT RNA转录物中，得到p53/UTX信使RNA；

p53/UTX信使RNA经MEGAclear试剂盒纯化后用热敏磷酸酶处理以及进一步纯化得到所需mRNA；

2）制备脂质聚合物复合信使RNA纳米粒

取PAMAM树枝状聚合物G0和1,2-环氧十四烷，合成阳离子脂质G0-C14；

采用优化的自组装策略，将步骤1）得到的mRNA与G0-C14 DMF混合，形成mRNA/G0-C14络合物，再在5 mg/ml的 DMF中快速加入250g PLGA，与配合物混合，达到均匀混合溶液；

磁力搅拌下，将混合溶液滴入10毫升无核酸的HyPure水，其中1mg DSPE-PEG-NH2、或者1mg DSPE-PEG-NH2/DSPE-PEG-SH混合物、或者1mg DSPE-PEG-SH构建得到NPs的脂质PEG外层；

经自组装稳定后，形成的NPs用预冷的无酶纯水使用Amicon过滤管冲洗，去除游离化合物和有机溶剂，洗涤后的纳米粒沉淀用PBS重悬成不同浓度的黏附型mRNA NPs，得到p53-mRNA及UTX-mRNA纳米粒。

2.如权利要求1所述的p53-mRNA及UTX-mRNA纳米粒的制备方法，其特征在于步骤1）中化学修饰反应体系具体为：纯化的聚合酶链式反应产物的添加量为1-2μg， 3′-O-Me-m7G(5′)ppp(5′)G帽结构类似物的添加量为6mM、三磷酸鸟苷的添加量为1.5mM、5-甲基-胞苷三磷酸的添加量为7.5mM、三磷酸腺苷的添加量为7.5mM、假尿苷-5’-三磷酸的添加量为7.5mM，反应温度为37℃，反应时间为4小时。

3.如权利要求1所述的p53-mRNA及UTX-mRNA纳米粒的制备方法，其特征在于步骤1）中热敏磷酸酶处理温度为37℃，处理时间为30分钟。

4.如权利要求1所述的p53-mRNA及UTX-mRNA纳米粒的制备方法，其特征在于步骤2）自组装策略中，mRNA 16μg与G0-C14 250μg进行混合15s，其中，mRNA的浓度为1mg/ml，G0-C14的浓度为2.5 mg/ml。

5.如权利要求1所述的p53-mRNA及UTX-mRNA纳米粒的制备方法，其特征在于步骤2）中DSPE-PEG-NH2/DSPE-PEG-SH混合物的重量比为1：1。

6.利用权利要求1-5任一所述方法得到的p53-mRNA及UTX-mRNA纳米粒在制备治疗肿瘤药物中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述治疗肿瘤药物为恢复p53及UTX抑癌功能的药物。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述恢复p53及UTX抑癌功能的药物具体为在膀胱癌中恢复p53、UTX抑癌功能的药物。

9.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述治疗肿瘤药物具体通过具有膀胱粘膜粘附功能的RNA纳米粒增加膀胱内p53-mRNA及UTX-mRNA药物停留时间从而使得信使RNA进入肿瘤细胞发挥抗肿瘤作用。