[发明专利]p53及UTX信使RNA纳米粒的制备方法及该信使RNA的应用

说明书

本发明公开了一种p53及UTX信使RNA纳米粒制备方法及其在膀胱癌治疗中的应用，属于基因工程技术领域。肿瘤抑癌基因信使RNA纳米粒通过下述方法制备：1）体外合成化学修饰p53‑mRNA及UTX‑mRNA，2）制备脂质聚合物复合信使RNA纳米粒。本发明中p53、UTX信使RNA成功通过纳米体系递送至膀胱癌细胞内，在体内外高效快速地诱导细胞凋亡和抑制促转移因子的表达从而显著抑制了肿瘤细胞的生长及转移；具有膀胱粘膜粘附功能的RNA纳米粒递送体系可以增加膀胱内p53‑mRNA及UTX‑mRNA药物停留时间从而使得信使RNA进入肿瘤细胞发挥抗肿瘤作用。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及p53及UTX信使RNA纳米粒的制备方法及该信使RNA的应用。

背景技术

膀胱癌(BCa)的遗传分析揭示了肿瘤抑癌基因在膀胱癌的发生发展中发挥重要作用。在这些失活基因中，具有抑制肿瘤生长的p53基因缺失高达50%，同时伴随另一种肿瘤抑癌基因UTX的缺失，UTX基因编码一种名为赖氨酸特异性去甲基化酶6A (Kdm6a)的组蛋白去甲基化酶，是一种重要的表观遗传调控因子，起着组蛋白H3K27去甲基化酶的作用。膀胱癌UTX的突变率约为20%-29%，因此，p53及UTX基因及其编码的蛋白在BCa中具有重要意义。

非病毒载体、脂质体试剂和病毒载体是目前最常用的DNA转染工具。然而，(i)非病毒lipofectamine试剂只能在体外使用(由于体内稳定性差)，以及(ii)基于病毒载体的技术可能会引起诸如包装容量低、生产成本高、免疫原性高以及可能传播到环境中的担忧。此外，DNA转染方法可能会导致基因组整合和突变的风险。设计出既能有效恢复p53、UTX功能又能避免上述问题的替代方法将不是一件容易的事情。

在此，我们提供了一种mRNA纳米颗粒(NP)介导的策略来靶向上调BCa中的p53、UTX水平。这种方法避免了病毒载体或质粒DNA导致的插入突变而导致有害整合到宿主基因组的潜在风险,即使在难以转染或不分裂的细胞中，mRNA仍然能够快速稳定地表达蛋白质。递送mRNA的纳米粒由FDA批准的聚合物聚(乳酸-羟基乙酸)酸(PLGA)构建，用于保护和装载mRNA/脂质复合物。一层脂质-聚乙二醇(PEG)被用于进一步保护NP核心，并在生理条件下稳定mRNA NP系统。目前使用NPs将mRNA在膀胱内传递到特定的原位膀胱肿瘤的研究还没有报道。在此，我们通过表面修饰赋予我们的mRNA NPs粘膜黏附特性，以在膀胱内有效地传递p53、UTX-mRNA。我们的结果从不同层次(包括蛋白水平,细胞水平,实验动物) 证明了本发明中p53、UTX信使RNA成功通过纳米体系递送至膀胱癌细胞内，在体内外高效快速地诱导细胞凋亡和抑制促转移因子的表达从而显著抑制了肿瘤细胞的生长及转移；并实现具有膀胱粘膜粘附功能的RNA纳米粒递送体系增加膀胱内p53-mRNA及UTX-mRNA药物停留时间从而使得信使RNA进入肿瘤细胞发挥抗肿瘤作用。

发明内容

针对现有技术中存在的传统RNA输送的瓶颈，如体内循环时间短、易被RNA酶降解、内涵体逃逸能力差等问题，本申请设计的目的在于提供p53及UTX信使RNA纳米粒的制备方法及该信使RNA的应用的技术方案，本发明结合聚合物生物材料的优点（化学组成、分子结构以及理化性能易于调控）和多肽材料的多种生物功能性（组织穿透性、器官和细胞靶向、膜穿透性等功能），制备了一种新型聚合物粘附性能纳米粒子载体，用于抑癌基因p53-mRNA及UTX-mRNA的膀胱内递送，在膀胱癌组织内实现了首次基于mRNA的抑癌因子p53-mRNA及UTX-mRNA的修复，在临床前动物模型原位膀胱癌中，实现了p53-mRNA及UTX-mRNA修复后的显著抑制膀胱癌增殖以及转移的效果。

该技术方案有效解决了DNA治疗方式存在潜在基因突变风险；以及小分子药物在抑癌基因缺失的情况下无效的两个国际难题，并能够克服膀胱癌灌注治疗的局限性（滞留时间短、药物无法粘附及无法持久释放等问题），具有巨大的临床转化潜力。

本发明的目的在于公开了p53及UTX信使RNA纳米粒。