[发明专利]单增李斯特菌的CPA引物、检测试剂盒和检测方法

权利要求书

1.单增李斯特菌的CPA引物，其特征在于：包括剥离引物4s、5a，交叉扩增引物2a1s，以及特异引物2a、3a；其核苷酸序列分别如下所示：

靶点hlyA剥离引物4s：5’-ccgtaagtgggaaatctg-3’(SEQ ID NO.1)

靶点hlyA剥离引物5a：5’-aggcaatgggaactcctg-3’(SEQ ID NO.2)

靶点hlyA交叉引物2a1s：5’-ctcgtaagtctccgaggttccttcaaagccgtaatt-3’(SEQ IDNO.3)

靶点hlyA特异引物2a：5’-ctcgtaagtctccgaggt-3’(SEQ ID NO.4)

靶点hlyA特异引物3a：5’-cccggttaaaagtagcacc-3’(SEQ ID NO.5)。

2.单增李斯特菌的检测试剂盒，其特征在于包括权利要求1所述的CPA引物。

3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于：所述CPA引物的浓度为10μM。

4.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于还包括如下组分：

A、2×反应缓冲液：40.0mM的Tris-HCl，20.0mM的硫酸铵，20.0mM的氯化钾，16.0mM的硫酸镁，0.2％(v/v)的Tween 20，1.4M的甜菜碱，10.0mM的dNTPs(each)；

B、Bst DNA聚合酶；

C、钙黄绿素和氯化锰的混合溶液。

5.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于：所述的Bst DNA聚合酶，浓度为8U/μL。

6.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于：所述钙黄绿素和氯化锰的混合溶液通过如下方法制备得到：

(i)将钙黄绿素溶于二甲基亚砜中，制成50μM的钙黄绿素溶液；将氯化锰溶于水中，制成1mM的氯化锰水溶液；

(ii)取25μL 50μM的钙黄绿素溶液与10μL1 mM的氯化锰水溶液混合均匀，得到钙黄绿素和氯化锰的混合溶液。

7.权利要求2-6任一项所述的检测试剂盒在检测单增李斯特菌中的应用。

8.单增李斯特菌的CPA检测方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)提取待检样品的细菌DNA作为模板DNA；

(2)建立检测hlyA的交叉引物恒温扩增反应体系，于59～68℃水浴中恒温反应至少60分钟，待反应完成后于75～85℃水浴中保温2分钟终止反应；

(3)针对靶点hlyA的检测，终止反应后肉眼观察反应体系的颜色，如颜色变为绿色，说明待检样品中含有单增李斯特菌；如颜色为黄色，说明待检样品中不含有单增李斯特菌。

9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于：步骤(3)中，终止反应后对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果呈现梯形条带说明待检样品含有单增李斯特菌，无扩增条带说明待检样品不含有单增李斯特菌。

10.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于：

步骤(1)所述的模板DNA，其OD₂₆₀/OD₂₈₀值为1.8～2.0；

步骤(2)交叉引物恒温扩增反应体系为：2×反应缓冲液12.5μL，10μM的剥离引物4s和10μM的剥离引物5a各1.5μL，10μM的交叉引物2a1s 2.5μL，10μM的特异引物2a和10μM的特异引物3a各1.25μL，DNA模板1.0μL，8U/μL的Bst DNA聚合酶1.0μL，加去核酸水补足至25μL；最后加入1μL的钙黄绿素与氯化锰的混合溶液。