[发明专利]单增李斯特菌的CPA引物、检测试剂盒和检测方法

说明书

本发明公开了单增李斯特菌的CPA引物、检测试剂盒和检测方法，该引物包括剥离引物4s、5a，交叉扩增引物2a1s，以及特异引物2a、3a；其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1‑NO.5所示。本发明针对单增李斯特菌特异性靶序列hlyA所设计的交叉引物恒温扩增反应检测鉴定体系，解决了现有的检测技术方法耗时长，灵敏度低，成本高，现场应用困难等缺陷。通过选择目标菌株的特异性序列hlyA的保守区域，设计一对剥离引物、交叉引物和特异引物构建交叉引物恒温扩增反应体系，并在60分钟左右获得检测结果以缩短传统单增李斯特菌检测的周期。

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体涉及单增李斯特菌的CPA引物、检测试剂盒和检测方法。

背景技术

单核细胞增生李斯特菌(简称单增李斯特菌)属于革兰氏阳性菌，是最常见的人畜共患食源性致病菌之一，能够引起较严重的人畜共患病，如肠胃炎、脑膜炎、败血症等疾病。且对于孕妇、婴幼儿、老年人及免疫力低下者更容易被感染。单增李斯特菌广泛存在于各类乳制品、蔬菜、肉类等食品中，具有极强的生命力，能够在-4℃～45℃，pH值为4～9，甚至高盐(14％及以上)等恶劣环境条件下存在。对人的健康构成极大的威胁。食品中单增李斯特菌的检测成为食源性疾病预防与控制的关键。

目前微生物的检测鉴定方法主要可以分为三类：传统培养鉴定法、免疫学检测法和分子生物学检测法。传统的培养鉴定法存在操作繁琐、耗时长的缺点，而免疫学检测法存在对实验人员专业水平要求高、成本较高以及检测结果易出现假阳性的不足。分子生物学检测法目前有PCR检测法、实时定量PCR技术、环介导恒温扩增法，但均存在易出现假阳性且检测成本较高的缺点。

发明内容

本发明的目的在于提供单增李斯特菌的CPA引物、检测试剂盒和检测方法，该引物和方法具有结果准确可靠，灵敏度高、特异性好，操作简便，成本低，适合于现场检测应用的特点。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

单增李斯特菌的CPA引物，是针对其靶点hlyA设计的，包括剥离引物4s、5a，交叉扩增引物2a1s，以及特异引物2a、3a；其核苷酸序列分别如下所示：

靶点hlyA剥离引物4s：5’-ccgtaagtgggaaatctg-3’(SEQ ID NO.1)

靶点hlyA剥离引物5a：5’-aggcaatgggaactcctg-3’(SEQ ID NO.2)

靶点hlyA交叉引物2a1s：5’-ctcgtaagtctccgaggttccttcaaagccgtaatt-3’(SEQID NO.3)

靶点hlyA特异引物2a：5’-ctcgtaagtctccgaggt-3’(SEQ ID NO.4)

靶点hlyA特异引物3a：5’-cccggttaaaagtagcacc-3’(SEQ ID NO.5)。

单增李斯特菌的检测试剂盒，包括上述的CPA引物；

所述试剂盒中，各CPA引物的浓度优选10μM；

所述的试剂盒还包括如下组分：

A、2×反应缓冲液：40.0mM的Tris-HCl，20.0mM的硫酸铵，20.0mM的氯化钾，16.0mM的硫酸镁，0.2％(v/v)的Tween 20，1.4M的甜菜碱，10.0mM的dNTPs(each)；

B、Bst DNA聚合酶：优选浓度为8U/μL的Bst DNA聚合酶水溶液。

C、钙黄绿素和氯化锰的混合溶液；通过如下方法制备得到：

(i)将钙黄绿素溶于二甲基亚砜(DMSO)中，制成50μM的钙黄绿素溶液；将氯化锰溶于水中，制成1mM的氯化锰水溶液；