[发明专利]一种研究乳酸影响肺癌细胞转移侵袭能力的方法

权利要求书

1.一种研究乳酸影响肺癌细胞转移侵袭能力的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、通过将肺癌细胞的观察EMT表型是否明显作为判断肺癌细胞的迁移能力和侵袭能力的指标，并将肺癌细胞置于乳酸环境中，以验证乳酸诱导EMT表型更加明显；

S2、推测乳酸能够促进肺癌细胞中Snail表达，而Snail表达诱导EMT表型更加明显，然后通过在肺癌细胞株中转染Snail的siRNA观察EMT表型是否逆转，以验证Snail表达诱导EMT表型更加明显；

S3、取两种体外肺癌细胞H1299和A549，分别将H1299和A549置于相同浓度的乳酸中，并通过抑制体外肺癌细胞H1299和A549自身的乳酸，然后，观察肺癌细胞H1299和A549的EMT表型；

S4、根据步骤S3观察结果，LKB1野生型的H1299的EMT表型明显、LKB1缺失型的A549的EMT表型不明显；

S5、推测乳酸通过控制LKB1诱导了Snail表达，并通过向A549内转入LKB1的cDNA，向H1299中敲除LKB1，再重复步骤S3，以验证LKB1诱导了Snail表达；

S6、推测过量乳酸影响了细胞内能量代谢的动态平衡，以提供LKB1的活性，或者导致LKB1胚系突变；

S7、推测LKB1可能通过调控下游激酶AMPK或者Src诱导了Snail表达；

S8、在H1299细胞中，敲除LKB1，在A549细胞中转入LKB1的cDNA，然后，通过对照试验，验证AMPK磷酸化是因LKB1活性改变导致；

S9、同时利用不同信号传导途径抑制剂，观察哪种信号通路抑制剂可影响乳酸对AMPK的磷酸化；

S10、将在LKB1缺失的A549细胞中，转入LKB1的cDNA，以及在LKB1野生型的H1299细胞中转入LKB1siRNA，检测LKB1与Src激酶间的关系，利用不同信号转导通路抑制剂筛选出介导LKB1调控Src激酶的信号通路。

2.根据权利要求1所述的一种研究乳酸影响肺癌细胞转移侵袭能力的方法，其特征在于，在步骤S8中，所述对照试验包括如下步骤，

S801、乳酸或过氧化氢在体外肺癌细胞中，对LKB1磷酸化和AMPK磷酸化的影响；

S802、向A549内转入LKB1的cDNA，按步骤S801处理A549；

S803、将已构建好的SOD2和线粒体过氧化氢酶的cDNA分别转染至肺癌细胞中,观察过表达SOD2和线粒体中过氧化氢酶能否影响乳酸或过氧化氢所诱导的AMPK磷酸化以及Snail的表达；

S804、将在H1299细胞中,敲除LKB1；在A549细胞中转入LKB1的cDNA，之后利用步骤S803中的方法处理细胞，明确此p-AMPK确实来源于LKB1活性改变。