[发明专利]一种研究乳酸影响肺癌细胞转移侵袭能力的方法

说明书

本发明公开了一种研究乳酸影响肺癌细胞转移侵袭能力的方法，包括如下步骤：S1、验证乳酸诱导EMT表型更加明显；S2、验证Snail表达诱导EMT表型更加明显；S3、观察肺癌细胞H1299和A549经乳酸处理的EMT表型；S4、LKB1野生型的H1299的EMT表型明显、LKB1缺失型的A549的EMT表型不明显；S5、验证LKB1诱导了Snail表达；S6、推测过量乳酸影响了细胞内能量代谢的动态平衡；S7、推测LKB1可能通过调控下游激酶AMPK或者Src诱导了Snail表达；S8、验证AMPK磷酸化是因LKB1活性改变导致；S9、同时利用不同信号传导途径抑制剂，观察哪种信号通路抑制剂可影响乳酸对AMPK的磷酸化；S10、利用不同信号转导通路抑制剂筛选出介导LKB1调控Src激酶的信号通路。本方法能够阐明肿瘤转移的分子机制。

技术领域

本发明涉及细胞治疗技术领域，具体涉及一种研究乳酸影响肺癌细胞转移侵袭能力的方法。

背景技术

肺癌目前相对的5年生存率仅为18％，造成肺癌病人远期生存率较低的主要原因是肿瘤的侵袭和转移，研究表明，约80-90％的肺癌死亡病例是由肿瘤转移引起的，而转移的分子机制尚不清楚。现有研究中发现肿瘤Warburg效应中其终产物乳酸通过诱导转录因子Snail来促进肺癌细胞EMT的发生，从而诱发侵袭转移，同时，发现能量代谢关键调控基因LKB1的相关通路介导了Warburg效应促进肺癌细胞侵袭转移的过程。

在现有技术中，缺乏一种对LKB1相关通路在介导Warburg效应促进肺癌细胞侵袭转移过程中的作用及机制的研究方法，从而无法筛选在此过程中的关键调控蛋白并明确其功能，为进一步阐明肿瘤转移的分子机制以及为肿瘤治疗提供新的分子靶点和思路。

发明内容

本发明的目的在于提供一种研究乳酸影响肺癌细胞转移侵袭能力的方法，以解决现有技术中因缺乏对LKB1相关通路介导Warburg效应的机制的研究，导致无法筛选LKB1相关通路参与调控的蛋白的技术问题。

为解决上述技术问题，本发明具体提供下述技术方案，

一种研究乳酸影响肺癌细胞转移侵袭能力的方法，包括如下步骤：

S1、通过将肺癌细胞的观察EMT表型是否明显作为判断肺癌细胞的迁移能力和侵袭能力的指标，并将肺癌细胞置于乳酸环境中，以验证乳酸诱导EMT表型更加明显；

S2、推测乳酸能够促进肺癌细胞中Snail表达，而Snail表达诱导EMT表型更加明显，然后通过在肺癌细胞株中转染Snail的siRNA观察EMT表型是否逆转，以验证Snail表达诱导EMT表型更加明显；

S3、取两种体外肺癌细胞H1299和A549，分别将H1299和A549置于相同浓度的乳酸中，并通过抑制体外肺癌细胞H1299和A549自身的乳酸，然后，观察肺癌细胞H1299和A549的EMT表型；

S4、根据步骤S3观察结果，LKB1野生型的H1299的EMT表型明显、LKB1缺失型的A549的EMT表型不明显；

S5、推测乳酸通过控制LKB1诱导了Snail表达，并通过向A549内转入LKB1的cDNA，向H1299中敲除LKB1，再重复步骤S3，以验证LKB1诱导了Snail表达；

S6、推测过量乳酸影响了细胞内能量代谢的动态平衡，以提供LKB1的活性，或者导致LKB1胚系突变；

S7、推测LKB1可能通过调控下游激酶AMPK或者Src诱导了Snail表达；

S8、在H1299细胞中，敲除LKB1，在A549细胞中转入LKB1的cDNA，然后，通过对照试验，验证AMPK磷酸化是因LKB1活性改变导致；

S9、同时利用不同信号传导途径抑制剂，观察哪种信号通路抑制剂可影响乳酸对AMPK的磷酸化；