[发明专利]一种体外诱导卵原细胞向卵母细胞分化的方法

权利要求书

1.一种体外诱导卵原细胞向卵母细胞分化的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S10、分离获得E11.5时期胎鼠的生殖嵴，同时取所述胎鼠的尾部组织进行性别鉴定，收集鉴定结果为雌性的所述生殖嵴，即为卵巢组织；

S20、将琼脂块置于24孔板中，并添加α-MEM培养基浸泡所述琼脂块10~14 h，以交换所述琼脂块中的水分，然后将所述卵巢组织置于所述琼脂块顶端的中间位置，再向所述24孔板中加入卵巢组织培养液，在37 ℃、5% CO₂下培养5~7天；

S30、将所述24孔板中的所述卵巢组织培养液更换成含有他莫昔芬的培养液，在37 ℃、饱和湿度以及5% CO₂下培养5~7天以促进卵泡的发生，然后将所述含有他莫昔芬的培养液更换为所述卵巢组织培养液，继续培养5~7天；

S40、将所述卵巢组织于卵泡分离操作液中分离出单个卵泡，并将所述卵泡转移到卵泡生长培养液中贴壁培养12~15天，直到能观察到明显的卵泡腔形成后，将所述卵泡生长培养液更换为卵泡成熟培养液，15~20 h后即可观察到MII时期的卵母细胞；

其中，所述卵巢组织培养液包括胎牛血清、维生素C、青链霉素和α-MEM培养基，其中，所述胎牛血清和所述青链霉素在所述卵巢组织培养液中的体积分数对应为10%和0.1%，所述维生素C的添加量为1.5mM；

步骤S30中，所述含有他莫昔芬的培养液包括胎牛血清、维生素C、他莫昔芬、青链霉素和α-MEM培养基，其中，所述胎牛血清和所述青链霉素在所述含有他莫昔芬的培养液中的体积分数对应为10%和0.1%，所述维生素C的添加量为1.5 mM，所述他莫昔芬的添加量为10 μM；

步骤S40中，所述卵泡分离操作液包括L-15 培养基、胎牛血清和青链霉素，其中，所述胎牛血清和青链霉素在所述卵泡分离操作液中的体积分数对应为5%和0.1%；

步骤S40中，所述卵泡生长培养液包括α-MEM培养基、胎牛血清、维生素C、青链霉素和促卵泡素，其中，所述胎牛血清和青链霉素在所述卵泡生长培养液中的体积分数对应为10%和0.1%，所述维生素C的添加量为1.5 mM，所述促卵泡素的添加量为50 mIU/ml；

步骤S40中，所述卵泡成熟培养液包括α-MEM培养基、胎牛血清、青链霉素、促卵泡素和人绒毛膜促性腺激素，其中，所述胎牛血清和青链霉素在所述卵泡成熟培养液中的体积分数对应为5%和0.1%，所述促卵泡素的添加量为0.1 IU/ml，所述人绒毛促性腺激素的添加量为1.2 IU/mL。

2.如权利要求1所述的体外诱导卵原细胞向卵母细胞分化的制备方法，其特征在于，所述性别鉴定步骤包括：

将所述胎鼠的尾部组织转移到PCR管中用于DNA提取，将提取到的所述DNA进行PCR反应，最后通过琼脂糖电泳判断PCR产物中是否有Sry基因条带，若有，则为雄性，反之，则为雌性。

3.如权利要求1所述的体外诱导卵原细胞向卵母细胞分化的制备方法，其特征在于，所述琼脂块的长为9~11 mm，宽为9~11 mm，高为4~6 mm。