[发明专利]一种体外诱导卵原细胞向卵母细胞分化的方法

说明书

本发明公开一种体外诱导卵原细胞向卵母细胞分化的方法，该诱导方法将雌性胎鼠E11.5时期卵巢组织用琼脂块进行三维培养，在卵巢组织培养液中5～7天后，再置于含有他莫昔芬的培养液中培养5～7天，促进了E11.5时期的卵原细胞在体外条件下形成大量初级卵泡，然后在卵巢组织液中培养5～7天；分离出单个卵泡，将分离出来的卵泡经过体外单卵泡贴壁培养和卵泡体外成熟培养，获得了大量MII期的卵母细胞。通过选取雌性胎鼠E11.5时期卵巢组织，使卵巢组织中只存在处于有丝分裂阶段的卵原细胞，构建了一种研究完整体外卵子发生过程的最佳模型；通过3D琼脂培养、含有他莫昔芬的培养基、以及实验步骤的设计，成功将早期卵原细胞在完全体外条件下诱导形成了MII期的卵母细胞。

技术领域

本发明涉及生殖生物学技术领域，特别涉及一种体外诱导卵原细胞向卵母细胞分化的方法。

背景技术

伴随着人类不孕不育问题的日益严峻，哺乳动物体外配子发生技术的研究一直是生殖生物学领域的热点研究问题。目前，在雄性上，利用精原干细胞体外诱导分化获得功能性的配子技术体系已经相对完善，但是，在雌性上利用早期有丝分裂阶段的卵原细胞体外高效获得功能性卵母细胞的技术体系仍有待进一步完善，尤其是卵原细胞减数分裂能否正常启动一直是研究卵子体外发生的难点问题。对于雌性小鼠而言，原始生殖细胞特化起源于胚胎6.25天(E6.25，embryonic day)，随后，原始生殖细胞不断的增殖，并于E12.5天完全迁移到生殖嵴中，此时的原始生殖细胞尚未启动减数分裂，称为卵原细胞。随后在E13.5天，在Stra8(Stimulated By Retinoic Acid 8)基因的驱动下，卵原细胞开始启动减数分裂，直到E16.5天时阻滞在第一次减数分裂前期的双线期阶段。之后，由于生殖细胞出现核分裂而胞质不完全分裂的现象，形成了大量生殖细胞簇，称为“germ cell cyst”。在小鼠出生前后，伴随着颗粒细胞侵入生殖细胞cyst，cyst中的优势生殖细胞逐渐形成由颗粒细胞包围的原始卵泡，这一过程中也称为“cyst breakdown”。

2016年，Obata等首次利用小鼠E12.5时期的胎鼠卵巢组织进行体外培养，成功在体外将早期生殖细胞诱导分化形成了功能性的卵子，实现了体外卵子发生过程。Obata在体外卵子发生过程中采用的是E12.5时期的卵巢组织，其原因在于传统的观点认为，小鼠减数分裂启动发生在E13.5，E12.5时期卵巢组织的生殖细胞尚未进入减数分裂。并且，由于小鼠在E12.5时期已经出现性别分化，此时的雌性卵巢组织即可从形态上与雄性区分开来，更利于后续的研究。

但是，随着近几年单细胞转录组测序技术的发展，在2021年《Science Advances》杂志上，Laird等发现在E12.5时期Stra8等减数分裂相关的基因已经表达，并且利用组织荧光染色分析发现E12.5时期的卵巢组织中已经存在STRA8阳性的生殖细胞，这就表明E12.5时期的卵巢组织已经有部分生殖细胞进入了减数分裂。因此，严格意义上而言，E12.5时期的卵巢组织并不是研究完整体外卵子发生过程的最佳模型。

发明内容

本发明的主要目的是提出一种体外诱导卵原细胞向卵母细胞分化的方法，旨在解决现有的研究完整体外卵子发生过程的模型不够准确的问题。

为实现上述目的，本发明提出一种体外诱导卵原细胞向卵母细胞分化的方法，该方法包括以下步骤：

S10、分离获得胎鼠E11.5时期的生殖嵴，同时取所述胎鼠的尾部组织进行性别鉴定，收集鉴定结果为雌性的所述生殖嵴，即为卵巢组织；

S20、将琼脂块置于24孔板中，并添加α-MEM培养基浸泡所述琼脂块10～14h，以交换所述琼脂块中的水分，然后将所述卵巢组织置于所述琼脂块顶端的中间位置，再向所述24孔板中加入卵巢组织培养液，在37℃、5％CO₂下培养5～7天；