[发明专利]一种SNV的外延探针式qPCR检测方法

权利要求书

1.一种SNV的外延探针式qPCR检测方法，其特征在于，包括一种引物和探针设计模式，该模式包括一组外延组分和一条下游引物；

其中外延组分包括外延引物、附属引物、附属探针；

外延引物除3’段与模板结合的区域外，在5’端向外延伸一段人工序列，人工序列依相对位置又分为5’段和3’段；

所谓附属引物，是一条可与人工序列5’段的反向互补序列反向互补的引物；

所谓附属探针，是一条可与人工序列3’段的反向互补序列反向互补的带有发光基团和萃灭基团的探针；

所谓下游引物，是指与外延引物构成一对上下游引物，在正常PCR体系中可对模板进行PCR扩增的引物；

在PCR扩增过程中，下游引物结合并循外延引物的延伸产物而延伸出的单链，可作为附属引物和附属探针的结合对象，并启动qPCR扩增；

这种将探针设计在引物5’端延伸区域而能启动探针式qPCR的引物和探针设计模式，称为外延探针式qPCR。

2.根据权利要求1所述的SNV的外延探针式qPCR检测方法，其特征在于，在外延探针式qPCR方法所包括的一组外延组分和一条下游引物的基础上，对外延引物的3’端进行改造，使3’端碱基与SNV的一种等位基因型匹配，同时，通过更换3’端第二个碱基或第三个碱基提高结合的特异性，该引物称为特异外延引物，所述的外延组分称为特异外延组分，该方法称为特异外延探针式qPCR方法。

3.根据权利要求2所述的SNV的外延探针式qPCR检测方法，其特征在于，在外延探针式qPCR检测体系中，在特异外延引物的上游设计一条外侧上游引物，在外侧上游引物与下游引物的扩增产物上，外侧上游引物与外延引物中间位置设置一条结合于模板上的带有不同荧光的内参探针，用以指示外侧上游引物与下游引物的扩增效率，扩增效率用Ct值表示；

通过比较该Ct值与外延引物上附属探针的Ct值，计算特异外延引物对应基因型的相对比例，该模式称为单向外延探针qPCR检测体系。

4.根据权利要求2所述的SNV的外延探针式qPCR检测方法，其特征在于，对于某个SNV的两种等位基因型，在其正链和反链上分别设计两种对应的特异外延组分，在其外侧分别设计外侧扩增引物；

两种特异外延组分的附属探针上带有不同的荧光，根据两种荧光的扩增曲线，判断SNV的两种基因型的相对比例，该模式称为双向外延探针qPCR检测体系。

5.根据权利要求2所述的SNV的外延探针式qPCR检测方法，其特征在于，对于某个SNV的两种等位基因型，在其正链或反链上同向设计两种特异外延组分，彼此竞争结合同一位置，两条特异外延组分的附属探针上带有不同的荧光，根据两种荧光的扩增曲线，判断SNV的两种基因型的相对比例，该方案称为单向成对外延探针qPCR检测体系。

6.根据权利要求3所述的SNV的外延探针式qPCR检测方法，其特征在于，针对新冠病毒COVID-19上变异位点N501Y设计的检测方案，判断模板中COVID-19的有无、N501Y的有无及比例；或者判断N501Y突变质粒在野生型质粒中的比例。

7.根据权利要求4所述的SNV的外延探针式qPCR检测方法，其特征在于，针对人基因UGT1A1上的c.-3279TG和c.1091CT两个SNP位点，使用不同的扩增引物和相同的两条通用探针，通过比较FAM荧光曲线与VIC的荧光曲线，可判断SNP的基因型。

8.权利要求1-7中任意一项所述的SNV的外延探针式qPCR检测方法的应用，其特征在于，所述的应用包括但不限于：

识别目标SNV的有无；

确定目标SNV的等位基因；或者

确定样本中目标SNV每一种等位基因的含量或者比例。