[发明专利]一种SNV的外延探针式qPCR检测方法

说明书

本发明公开了一种针对单碱基变异(SNV)的外延探针式qPCR检测方法，根据已知单碱基变异位点设计4条引物，其中两条为外侧引物，两条为特异引物，特异引物3′端碱基分别与突变模板和正常模板碱基互补，3′端附近碱基可引入或不引入错配，其5′端外延一段人工序列，人工序列的5′段设计一条同向附属引物，3′段设计一条附属探针，在特异引物与下游引物扩增中，特异引物上的附属探针在附属引物延伸中被降解和发光以指示特异引物的扩增效率。如仅测单碱基变异位点的一种基因型，可使用两条外侧引物、一条特异引物及特异引物的附属引物及探针。本方法尚有多个实现模式，本方法较探针式AS‑PCR有更高的灵敏度和更低的成本。

技术领域

本发明涉及基因检测领域，具体涉及一种针对单碱基变异(SNV)的外延探针式qPCR检测方法。

背景技术

单核苷酸变异(Single nucleotide variants,SNV)是DNA序列中单一核苷酸的变异。单核苷酸变异在人类基因组或其他生物基因组中广泛存在,其在RNA转录、蛋白质表达等生物过程中起调控作用,并与人类疾病密切相关。在本文中，SNV包括SNP，不根据单碱基变异的人群频率、变异来自生殖细胞还是体细胞而加以区分或赋予不同名称。

SNV的检测有多种方法，如PCR-Sanger测序法、二代测序法、焦磷酸测序法、TaqMan探针qPCR法，PCR-RFLP酶切法、Multiplex SNaPshot法、Sequenom MassArray法、AS-PCR法、芯片法等等。如针对少数位点进行大量样本的检测，可选择使用引入探针的AS-PCR(allelespecific PCR)方法及TaqMan探针qPCR法。

典型的AS-PCR由四条引物构成：外侧上游引物，外侧下游引物，内侧上游特异引物，内测下游特异引物。其中，内侧上游特异引物和内测下游特异引物分别与DNA的正链与反链结合，其3’末端分别与DNA上同一SNV的不同等位基因型匹配。在3’末端第二位或第三位，通过引入故意错配而提高特异引物的特异性(这一点不是必须的)。因此，四条引物分别有三种扩增产物：外侧上游引物与外侧下游引物扩增，其产物既作为扩增的内参，也为特异引物的扩增提供更多模板；外侧上游引物与内测下游特异引物，用于扩增内测下游特异引物对应的SNV等位基因型；内侧上游特异引物与外侧下游引物，用于扩增内测上游特异引物对应的SNV等位基因型。外侧上游引物与内测下游特异引物的扩增产物，内侧上游特异引物与外侧下游引物的扩增产物，其长度不同。扩增后经电泳，通过两条特异引物扩增条带的有无，判断SNV为野生型、突变型或是杂合型。

对于AS-PCR的典型模式及各种变式，如使用qPCR方式进行检测而又不引入探针，则一般只能通过熔解曲线法进行分辨。这种方式因扩增产物的Tm值的不同而不稳定，很难用于临床检测。如欲在体系中引入探针，传统上必须使用第四种变式。这是因为，无论外侧上游引物与内测下游特异引物的扩增产物，还是内侧上游特异引物与外侧下游引物的扩增产物，都被外侧上游引物与外侧下游引物的扩增产物所覆盖，而后者是AS-PCR典型模式下的必然产物。这样，外侧上游引物与内测下游特异引物的扩增产物，或者内侧上游特异引物与外侧下游引物的扩增产物，其上都不能设计特异性的探针用以指示特异引物参与的扩增产物。而第四种变式，由于仅保留了一条外侧引物和对应的内侧特异引物，通过扩增曲线可反映特异引物的3’末端碱基结合情况，而不受另外产物的干扰。因此，这种方法已经广泛应用于临床癌症SNV检测、病毒变异位点检测等多种应用场景。该变式的缺陷在于，由于特异引物上引入故意错配而导致了结合效率的下降，这种结合效率的下降，不能通过两条外侧引物扩增提供的模板加以弥补，在多数情况下会导致检测灵敏度和特异性的降低。

发明内容

针对上述问题，本发明拟解决的技术问题是设计一种qPCR检测方案，以获得更为精确、低成本的检测核酸变异位点的方法。