[发明专利]一种利用印度洋交替单胞菌制备普鲁兰酶的方法

权利要求书

1.一种利用印度洋交替单胞菌制备普鲁兰酶的方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)菌株Alteromonas sp.162的发酵

将试管斜面保存的菌株Alteromonas sp.162接种于液体培养基中，所述液体培养基组成为普鲁兰多糖5-10g，蛋白胨0-1g，酵母粉0.1-0.25g，陈海水1000mL，pH值7.0-7.2；培养基于100-120℃灭菌30-50min；冷却后，将试管斜面保存的菌株Alteromonas sp.162接种到500mL的三角瓶中，其中含300mL培养基，于10-15℃，200-250rpm下振荡培养24-48h后，得发酵液；

(2)菌株Alteromonas sp.162的普鲁兰酶编码基因pulA的克隆

收集产酶菌体，提取基因组；采用普鲁兰酶编码基因的引物，pul-F5’-CGCGGATCCATGTTAACGAAACC-3'，pul-R5’-CCGCTCGAGTTTTGCGCTCACGGT-3'进行PCR扩增；PCR体系为50μL，包括：基因组DNA，1μL；10μM pul-F，1μL；10μM pul-R，1μL；5×PCR缓冲液，10μL；2.5mM dNTPs，4μL；DNA polymerase，1μL；ddH₂O，32μL；PCR反应条件：预变性温度95℃，3min；变性温度95℃，30sec；退火温度57℃，30sec；延伸温度72℃，3min；35个循环；总延伸72℃，5min；获得扩增产物；

取25-50μL扩增产物进行回收，将回收的目的基因pulA与pEASY-Blunt克隆载体进行连接，连接体系为5μL，包括：目的DNA，4μL；pEASY-Blunt克隆载体，1μL；将所述连接体系轻轻混合，室温下反应30-60min获得重组质粒pEASY-Blunt+pulA；将重组质粒pEASY-Blunt+pulA转入E.coli DH5α感受态细胞，取200μL转化后的重组细胞E.coli DH5α涂布于含有终浓度为50μg/mL卡那霉素的LB培养基平板上，置于37℃过夜培养；

挑取平板上的单克隆，利用PCR方法鉴定插入了目的基因pulA的阳性克隆；通用引物为M13-F5’-CAGGAAACAGCTATGACC-3'，M13-R5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3'；PCR体系为50μL，包括：基因组E.coli DH5α，1μL；10μM M13-F，1μL；10μM M13-R，1μL；5×PCR Buffer，10μL；2.5mM dNTPs，4μL；DNA polymerase，1μL；ddH₂O，32μL；PCR反应条件：预变性95℃，3min；变性温度95℃，30sec；退火温度50℃，30sec；延伸温度72℃，3min；35个循环；总延伸72℃，5min；反应后取5μL扩增产物，于1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，能扩增出目的条带即为阳性克隆；将阳性克隆接种到含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，置于37℃、180rpm的摇床中振荡培养过夜后10000rpm离心10min，收集菌体，提取重组质粒pEASY-Blunt+pulA，并进行测序；

(3)菌株Alteromonas sp.162的普鲁兰酶编码基因PulA序列分析

通过序列比对，普鲁兰酶基因PulA的ORF全长是4347bp，编码了一个含有1449个氨基酸的蛋白质PulA；该蛋白质PulA与来源于Alteromonas sp.的普鲁兰酶具有较近的亲缘关系；该蛋白质PulA理论分子量为158.68kDa，属于PulA超家族；

(4)菌株Alteromonas sp.162的普鲁兰酶重组质粒构建

采用限制性内切酶BamHI和XhoI分别对重组质粒pEASY-Blunt+pulA与表达载体质粒pET-28a(+)进行双酶切，重组质粒酶切体系为50μL，包括：XhoI，1μL；BamHI，1μL；CutSmart缓冲液，5μL；重组质粒，10μL；ddH₂O，33μL；表达质粒pET-28a(+)酶切体系为50μL，包括XhoI，1μL；BamHI，1μL；CutSmart缓冲液，5μL；表达质粒，5μL；ddH₂O，38μL；将反应体系混合均匀后，置于37℃水浴锅中保温30min；

将回收、纯化的目的基因pulA与表达载体pET-28a(+)进行连接；连接体系为20μL，包括：T4 DNA ligase，1μL；T4 DNA ligase缓冲液，2μL；pulA，12μL；载体，5μL；将连接体系轻轻混匀，置于16℃过夜；反应结束后所得的重组质粒为pET28a+PulA；

(5)普鲁兰酶PulA的诱导表达

将重组质粒pET28a+PulA转入大肠杆菌感受态细胞E.coli BL21(DE3)，随后取200μL转化后的重组细胞E.coli BL21(DE3)-pET28a+PulA涂布到含50μg/mL卡那霉素的LB培养基平板上，置于37℃培养箱中过夜培养；

采用T7通用引物T7-p5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3'，T7-ter5’-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3'对目的基因pulA进行PCR扩增，鉴定阳性克隆；将阳性克隆接种到含卡那霉素50μg/mL的LB液体培养基中，置于37℃、180rpm下振荡培养，作为种子液；再以1.0％的接种量将其接种于300mL含有50μg/mL卡那霉素的液体LB培养基中，16℃、150rpm下振荡培养；当菌液浓度达到OD₆₀₀为0.6-0.8时，加入终浓度为0.2mM的IPTG后继续置于16℃、150rpm摇床中振荡培养过夜；将诱导培养后的重组菌株BL21(DE3)-pET28a+pulA于4℃、7500rpm下离心15min，沉淀菌体采用PBS缓冲液洗涤两次后再重悬于20mL PBS缓冲液中，于高压细胞破碎仪中进行细胞破碎，4℃、10000pm下离心30min，得到胞内可溶组分；

(6)普鲁兰酶PulA的纯化

首先用10倍柱体积的ddH₂O清洗镍柱，再用5倍柱体积的结合缓冲液平衡镍柱；然后将要纯化的样品进行上样；上样后再用5倍柱体积的结合缓冲液洗去未结合的杂蛋白；最后用3倍柱体积的洗脱缓冲液洗脱带有His标记的目的蛋白，收集各个组分，进行SDS-PAGE验证纯化蛋白，获得普鲁兰酶；

(7)菌株Alteromonas sp.162普鲁兰酶截断突变体的构建

利用primer premier 6.0设计普鲁兰酶截断突变体引物，Puld5-F5'-CCGCTCGAGCAAACCGTAACCTTGTGCGC-3'，Puld5-R5'-CGCGGATCCCAGTACATGCTCTGAAGTCA-3'，以步骤(2)获得的含普鲁兰酶基因pulA的质粒为模板，扩增点截断变体基因puld5，扩增条件同步骤(2)，退火温度重新设为52℃；对puld5基因进行回收、连接转化，获得重组质粒pEASY-Blunt+Puld5，条件同步骤(2)；通过测序验证截断突变体的基因序列；

(8)菌株Alteromonas sp.162普鲁兰酶截断突变体异源表达和纯化

对重组质粒pEASY-Blunt+Puld5与表达载体质粒pET-28a(+)进行双酶切，并制备含目的基因puld5的重组质粒pET28a+Puld5，条件同步骤(2)；重组质粒pET28a+Puld5异源表达条件同步骤(5)，纯化条件同步骤(6)；

(9)菌株Alteromonas sp.162普鲁兰酶点突变体构建

利用primer premier 6.0设计点突变体引物，H611Q-F5'-TGGGGTTATGATCCACAACATTTTAACGCTC-3'，H611Q-R5'-TTGTGGATCATAACCCCAATTAAAACCATCA-3'，以步骤(2)获得的含普鲁兰酶基因pulA的质粒为模板，扩增点截断变体基因h611Q，扩增条件同步骤(2)；对h611Q基因进行回收、连接转化，获得重组质粒pEASY-Blunt+H611Q，条件同步骤(2)；通过测序验证点变体的基因序列；

(10)菌株Alteromonas sp.162普鲁兰酶点突变体异源表达和纯化

对重组质粒pEASY-Blunt+H611Q与表达载体质粒pET-28a(+)进行双酶切，并制备含目的基因h611Q的重组质粒pET28a+H611Q，条件同步骤(2)；重组质粒pET28a+Puld5异源表达条件同步骤(5)，纯化条件同步骤(6)；

(11)菌株Alteromonas sp.162普鲁兰酶点叠加突变体构建

利用普鲁兰酶截断突变体引物，Puld5-F5'-CCGCTCGAGCAAACCGTAACCTTGTGCGC-3'，Puld5-R5'-CGCGGATCCCAGTACATGCTCTGAAGTCA-3'，以步骤(10)获得的含普鲁兰酶基因h611Q的质粒为模板，扩增叠加突变体基因puld5/h611Q，扩增条件同步骤(2)，退火温度重新设为52℃；对puld5/h611Q基因进行回收、连接转化，获得重组质粒pEASY-Blunt+Puld5/H611Q，条件同步骤(2)；通过测序验证叠加变体的基因序列；

(12)菌株Alteromonas sp.162普鲁兰酶叠加突变体异源表达和纯化

对重组质粒pEASY-Blunt+Puld5/H611Q与表达载体质粒pET-28a(+)进行双酶切，并制备含目的基因h611Q的重组质粒pET28a+Puld5/H611Q，条件同步骤(2)；

重组质粒pET28a+Puld5/H611Q异源表达条件同步骤(5)，纯化条件同步骤(6)；

(13)酶活力分析测定

用3,5-二硝基水杨酸法来测定，具体步骤为：取1.0mL的底物溶液在45℃下恒温10min；随后加入1.0mL酶液充分混匀后置于45℃的水浴中反应30min；以加热变性后的酶液作为对照组；反应结束后立即吸取1mL反应液与1.5mL DNS试剂混合，沸水浴加热5min后迅速用冰水混合物结束反应；最后加入蒸馏水至10mL，上下颠倒混匀于540nm处测定反应混合物的吸光度值OD₅₄₀；

酶活计算公式：酶活

其中，0.67为葡萄糖标准曲线的斜率；ODt为三个实验组在540nm处吸光值的平均值；OD₀为对照组在540nm处的吸光值；1000为单位换算倍数；n为稀释倍数；180为葡萄糖的分子量；30为反应时间，单位为min；

普鲁兰酶和普鲁兰酶点突变体均不能分泌胞外普鲁兰酶；普鲁兰酶截断突变体Puld5的胞外组分、胞内上清和胞内沉淀的酶活性分别为30.5％、62.2％和7.3％；叠加突变体Puld5/H611Q的胞外组分、胞内上清和胞内沉淀的酶活性分别为35.1％、59.2％和5.7％；普鲁兰酶酶活力为58.05U·mg^-1，普鲁兰酶截断突变体较普鲁兰酶有所降低，普鲁兰酶点突变体酶活力为87.63U·mg^-1，普鲁兰酶叠加突变体比活力最高达到145.2U·mg^-1，比普鲁兰酶酶活力提高了2.5倍；

(14)酶学性质

测定普鲁兰酶和普鲁兰酶突变体的最适pH，测定不同温度的酶活力，60℃处理不同时间，测定残存酶活力来确定酶的热稳定性；结果表明，普鲁兰酶和普鲁兰酶突变体最适pH相同，为6.0；

截断突变体Puld5的最适作用温度为45℃，比普鲁兰酶的提高了10℃，普鲁兰酶点突变体和叠加突变体的最适反应温度为50℃，比普鲁兰重组酶提高15℃，截断突变体Puld5的热稳定性高于普鲁兰酶，半衰期约为25h，为普鲁兰酶的2.5倍左右；点突变体半衰期约为20h，为普鲁兰酶的2.0倍左右，叠加突变体对温度不敏感，60℃时酶活力为最大酶活力的80％以上；半衰期为普鲁兰酶的5倍；

(15)酶动力学参数

测定酶动力学参数：在35℃、pH 6.0的条件下，分别测定在普鲁兰糖浓度的初始反应速度；采用OriginPro 9.0中的线性拟合方法，用双倒数作图法作1/V-1/[S]曲线并求出K_m及V_max值；

普鲁兰酶PulA的Km值为1.78mg·mL^-1，K_cat为1645.5s^-1，其催化效率为924.4s^-1·mg^-1·mL，截断突变体Puld5的Km值为2.08mg·mL^-1，说明截断突变体与底物结合的能力降低，截断突变体的催化效率降低，为普鲁兰酶的86.7％；点突变体H611Q的Km值为1.38mg·mL^-1，K_cat为1668.5s^-1，其催化效率为1209.1s^-1·mg^-1·mL，约为普鲁兰酶的1.3倍；叠加突变体Puld5/H611Q的K_m值为1.71mg·mL^-1，K_cat为1863.6s^-1，其催化效率为1089.8s^-1·mg^-1·mL，约为普鲁兰酶的1.2倍。